배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도
Summary
In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.
Abstract
Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.
Introduction
심장 질환은 세계에서 가장 주요 원인 오늘날 남아 사망률은 지난 20 년 (미국 심장 협회)에서 이뤄지지 않고있다. 효과적으로 방지 또는 심부전를 취소하는 신규 한 치료 전략의 개발에 대한 중요한 필요가있다. 한가지 유망한 전략은 줄기 세포 생물학 (1)의 급속한 발전 다음 세포 기반 치료이다. 이와 관련, 다 능성 클릭당 비용 (CPC)으로 인해 증식하지만 심장 혈통 차별화하기 위해 최선을 다하고 자신의 능력으로 치료를위한 우수한 셀 소스 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 강력한 방법은 생성과 심장 세포 치료제 연구를위한 매우 중요하다 클릭당 비용 (CPC)을 분리합니다.
이 프로토콜은 초기 배 발생 및 방법는 ESC에서 자신의 세대에서 확인 된 배아 클릭당 비용 (CPC)에 초점을 맞추고있다. 다양한 클릭당 비용 (CPC)에도 뼈 된 marrows 2에서, 배아와 성인 마음에서 고립되었다. 배아 개발하는 동안, 뼈 morphoge마그네틱 단백질 (BMP 형식)은, 날개 형 MMTV 통합 사이트 가족 (Wnts)와 마디 신호는 Mesp1 + 능성 중배엽 3의 헌신을 유도한다. Mesp1 + 세포는 배아의 CPC 사로 분화. 이 클릭당 비용 (CPC)은 일반적으로 NK2의 호 메오 박스 (5) (Nkx2-5가), ISL LIM의 호 메오 박스 (1) (Isl1가), T-상자 5 (Tbx5) 및 심근 증강 인자 2C (Mef2c가), 차 및 제 마음 필드를 형성, HCN4으로 표시하고 있습니다 cardiogenesis ~ 10시 심장의 주요 부분에 기여하고 있습니다. Nkx2-5 + 및 Isl1 + / Mef2c + 두 클릭당 비용 (CPC)가 심근 세포로 분화 할 수있는, 평활근 세포 (SMCs) 및 내피 세포 5-8. 따라서 이들의 CPC 심장 혈관계뿐만 아니라 심장 조직을 야기하고 심장 세포 기반 치료를위한 이상적인 셀 소스있는 것이다. 결과적으로, 시험 관내에서 CPC를 생성하는 심혈관 연구에서 주요 연구 초점이되어왔다. 는 ESC 무제한 확장 용량을 가지고 있기 때문에ND 포배기에서 ICM 세포를 나타내고, 천연 배아 배아 다음의 CPC는 ESC로의 분화는 CPC를 획득하기 위해 논리적이고 효과적인 방법으로 간주된다.
는 ESC에서 클릭당 비용 (CPC)을 얻을 수있는 한 넓게 적용 방법은 사채 11로는 ESC를 집계하는 것입니다. 분화 효율을 향상시키기 위해, 심장 개발 기술에 기초하여 정의 화학적 및 성장 인자 12-14 사용되고있다. 그러나, 현장에서 널리 허용되는 명확한 CPC 마커, 특히 아니 세포 표면 마커는 없다. 이 문제를 해결하기는 ESC는 Isl1 + 또는 Mef2c + 클릭당 비용 (CPC) 및 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 사용하여 형광 기자들과 이들의 유도체를 표시하도록 설계되었습니다. CRE 재조합 효소는 Isl1 / Mef2c 프로모터 / 인핸서의 제어에 노크한다. 구성 적 프로모터에 의해 구동되는 형광 단백질의 변성 또는 RFP YFP 유전자 CRE 재조합 효소와 플록스 정지 코돈의 절단에 의해 활성화 될 수있다(ISL1 : CRE;-pCAG – 플록스-STOP-플록스 GFP 또는 RFP / Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) 5,6. 는 ESC가 두 번째 심장 필드 클릭당 비용 (CPC)로 분화되면, Isl1 / Mef2c 프로모터 / 증강 구동 CRE는 형광 기자를 활성화하고 클릭당 비용 (CPC)은 FACS 정화에 의해 강화 될 수있다. 간략하게, EB 집계 방법은 ESC의 분화를 시작하는 데 사용된다. 분화 효율을 향상시키기 위해, 분화 세포는 아스코르브 산 (AA) 및 BMP4, 티빈 13,15 VEGF와 같은 성장 인자로 처리된다. 이 프로토콜은 마우스와 인간는 ESC를 모두 사용하여 강력하고 효율적인 CPC 차별화 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E |
| Knockout SR | Life technology | 10828028 |
| Knockout DMEM | Life technology | 10829018 |
| DMEM | Life technology | 11965118 |
| NEAA | Life technology | 11140050 |
| GlutaMAX | Life technology | 35050061 |
| N2 | Life technology | 17502048 |
| B27 | Life technology | 12587010 |
| Ham’s F12 | Life technology | 11765062 |
| IMDM | Life technology | 12440061 |
| Pen/Strep | Life technology | 15140122 |
| Pyruvate | Life technology | 11360070 |
| Dispase | Life technology | 17105041 |
| Stempro-34 | Life technology | 10639011 |
| DMEM/F12 | Life technology | 11330032 |
| BSA | Life technology | 15260037 |
| Trypsin | Life technology | 25200056 |
| Ascobic Acid | Sigma | A5960 |
| 1-Thioglycerol | Sigma | M1753 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
| VEGF | R&D | 293-VE |
| Bmp4 | R&D | 314-BP |
| ActivinA | R&D | 338-AC |
| bFgf | R&D | 233-FB |
| Fgf10 | R&D | 345-FG |
| mTeSR | Stemcell technologies | 5850 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
Referências
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