Silicium poreux microparticules pour la livraison de siRNA Therapeutics

Summary

Livraison reste le principal défi pour la mise en œuvre thérapeutique de petits ARN interférents (siRNA). Ce protocole implique l'utilisation d'une plate-forme de délivrance de siRNA biocompatible et multifonctionnel, constitué par l'arginine et polyéthylènimine greffé microparticules de silicium poreux.

Abstract

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Introduction

Les petits ARN interférents (siRNA) sont des molécules d'ARN double brin qui peuvent supprimer l'expression des gènes. Au cours des dernières années, siRNA ont été développés comme une nouvelle génération de biomédicaments qui montrent un potentiel thérapeutique pour une utilisation future dans les applications cliniques ^1-5. Cependant, la mise en œuvre réussie de la thérapie siRNA reste un défi considérable, en raison de la dégradation par les nucléases, une mauvaise absorption intracellulaire, la faible efficacité de transfection et la libération inefficace de l'endosome / ⁵ lysosome. Beaucoup de ces obstacles peuvent être surmontés par le développement de plates-formes de livraison, qui peuvent en toute sécurité et efficacement offrir siRNA pour les tissus malades. Comparé aux transporteurs virales, les plates-formes non-virales offrent plusieurs avantages, tels que la sécurité, le faible coût et la facilité d'adaptation. En particulier, les nanoparticules cationiques, tels que des polymères et des lipides, se sont révélés utiles pour la délivrance de siRNA ^3.

Auparavant, nous avons développé un dr discoïdeug système de distribution, appelé le vecteur à plusieurs étages (MSV). Cette plate-forme est basée sur les étapes séquentielles, dans lequel un véhicule est libéré à partir de l'autre. Le premier véhicule de l'étape est un microparticules biodégradables fabriqués à partir de silicium poreux (PSI), tandis que les secondes véhicules de scène sont des nanoparticules chargées de médicaments ou d'agents de contraste ^6,7. Les nanoparticules qui sont noyés dans le matériau de PSI sont progressivement libérés comme le Si dégrade ^8. Un avantage d'utiliser des particules de Si est que les caractéristiques de morphologie et de surface peuvent être facilement adaptées pour réaliser la biodistribution et la libération du médicament optimal. Récemment, l'utilisation réussie de la plate-forme MSV pour la fourniture de liposomes à siARN tissu tumoral a été démontré dans un modèle de souris de l'ovaire et le cancer du sein ^{9, 10.}

Dans ce travail, nous avons fabriqué un système de distribution universel pour siRNA basée sur les principes de la plate-forme de MSV. L'efficacité de ce système de livraison a déjà été démontré nousment différente des molécules de siRNA ^11. Le système est un silicium poreux (PCPS) porte-polycation-fonctionnalisé, comprenant des ISP greffé avec la polyéthylèneimine (PEI) et l'arginine (Arg). PEI peut aider à former des interactions électrostatiques avec des siRNA, tandis que Arg et psi peuvent servir à réduire la toxicité de PEI, comme précédemment demonstarted ^11. En outre, la présence de PEI peut aider à l'absorption intracellulaire et endosomal évasion, tandis que les microparticules de l'ISP permettent la protection de siRNA et la libération prolongée. Les particules de l'ISP dégradent peu à peu dans des conditions physiologiques, ce qui conduit à la formation de nanoparticules Arg-PEI / siRNA (figure 1), qui ont une morphologie distincte et une distribution de taille étroite ^11. Pour plus de détails au sujet de la stabilité du système PCPS / siRNA, se il vous plaît se référer à l'étude de Shen et al. ^11. Cette plate-forme de PCPS diffère de la MSV classique, puisque les secondes nanoparticules de scène ne sont pas initialement Present dans le support, mais sont formées au fil du temps que le support de premier étage dégrade ^{11, 12.} L'efficacité siRNA chargement efficacité, la cytotoxicité et silençage génique du système PCPS a été évaluée in vitro. L'efficacité de transfection a été mesurée en utilisant le siRNA contre l'ataxie télangiectasie mutée (ATM) oncogene, qui est impliqué dans la réparation de l'ADN ^10. Auparavant, la suppression de l'ATM a été montré pour diminuer la croissance tumorale dans un modèle de cancer du sein ^10.

Protocol

1. Préparation de particules PCPS Oxyder les particules de silicium poreux non-fonctionnalisés dans une solution à 30% de peroxyde d'hydrogène à 95 ° C pendant 2 heures. Aminer les particules oxydées dans 2% (3- aminopropyl) triéthoxysilane solution dans l'alcool isopropylique pendant 2 jours à 65 ° C sous agitation douce. Centrifuger la solution pendant 30 min à 18 800 xg et laver les particules deux fois dans de l'alcool isopropylique et trois fois dans de l'éthanol, en…

Representative Results

Ce protocole décrit l'utilisation d'un système de distribution non viral sûr et efficace pour la transfection de siRNA. Les résultats de SEM montrent que les particules PCPS sont de forme cylindrique et ont un diamètre de 2,6 um (figure 2A). Les particules sont chargées positivement à un potentiel zêta d'environ 8,21 (figure 2B), ce qui permet la liaison électrostatique avec des nucleotides chargés négativement. Les images confocales de différentes couches de par…

Discussion

Ce protocole décrit un procédé pour le succès de livraison de siRNA et la transfection dans les cellules. En particulier, la délivrance de siRNA est obtenue en utilisant une plate-forme multifonctionnelle constituée de particules de l'ISP polycation-fonctionnalisé. L'utilisation de la thérapie siRNA a un grand potentiel, par exemple, le traitement du cancer, que divers oncogènes peuvent être ciblées avec une grande spécificité. Par conséquent, il existe une demande pour développer des vé…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company/Institution	Catalog Number	Comments/Description
Polyethylenimine (PEI), branched	Sigma-Aldrich	408727	Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH	Sigma-Aldrich	408-468	99%
(3-​Aminopropyl)​triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	99%
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	30 wt. % in H2O
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741	100.00%
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	≥99.7%
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	≥99.5%
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma-Aldrich	03449	≥99%
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A7030-10G	Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA	Sigma-Aldrich		Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T9650	For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379	Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	For Western blot
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	For making phosphate buffer
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640	For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG	Sigma-Aldrich	A4416	Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	130672	98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid	Greiner Bio-One	655182	96-well plate
10X Tris-Glycine Liquid	Li-Cor	928-40010	Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	Sc-281692	Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G5421	Proliferation assay
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP399-500	10 X Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.)	Fisher Scientific	MT-15-017-CM	Cell culture media, 1X solution
Triton X-100	Fisher Scientific	AC21568-2500	Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass	Fisher Scientific	12-530C
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes	Fisher Scientific	14-377-010	For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant	Fisher Scientific	14-754-34	Spray for removing RNAse contamination
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	Visualization of RNA
Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555	Qiagen	1027294	Fluorescent control siRNA
Cell scraper	Celltreat	229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates	Thermo Scientific	130184	6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X)	Thermo Scientific	84788	Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227	Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X)	Thermo Scientific	78430	Protease inhibitor cocktail, use at 1X
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Scientific	75002440	Centrifuge
Beta Actin Antibody	Thermo Scientific	MA1-91399	β-actin primary antibody (from mouse) for western blor
6X TriTrack DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R1161	DNA loading dye
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
Non-Fat Dry Milk	Lab Scientific	M0841	For Western blot
2-well BD Falcon culture slides	BD Biosciences	354102	2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent.	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Western blot detection reagent
BA Membranes	GE Healthcare Life Sciences	10402096	Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb	Cell Signaling	2873S	ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074	Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot
Folded capillary cells	Malvern	DTS 1061	For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line	ATCC	HTB-26	Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-rad	456-1043	For Western blot
Biorad PowerPac HC	Bio-rad	164-5052	Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer	Bio-rad	161-0732	Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-rad	170-4405	Electrophoresis equipment for DNA agarose gel
Mini-PROTEAN Tetra cell	Bio-rad	165-8000	Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software	Bio-rad	170-8265	Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer	Ted Pella	16007	Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R	Eppendorf	22670107	Shaker
Isoton II diluent	Beckman Coulter	8546719	Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076	Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles	Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin		Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS	Malvern		Particle analyzer system for size and zeta potential
Scanning Electron Microscope	FEI		Particle size and shape
Atomic Force Microscope	Bruker		Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope	Olympus		Visualization of fixed and live cells