Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов
Summary
Живая томография эмбрионального улитки млекопитающих является сложной задачей, так как процессы развития в стороны действуют на временной градиента над десяти дней. Здесь мы представляем метод для культивирования, а затем визуализации эмбриональных кохлеарной эксплантов тканей, взятых из флуоресцентного репортера мыши в течение пяти дней.
Abstract
Здесь мы представляем метод для долгосрочного покадровой съемки живых эмбриональных мыши кохлеарных эксплантов. Программа развития отвечает за строительство высоко упорядоченную, сложную структуру млекопитающих улитки доходов в течение приблизительно десяти дней. С целью изучения изменений в экспрессии генов за этот период и их реакцию на фармацевтических или генетических манипуляций, долгосрочное изображений необходимо. Ранее в прямом эфире формирования изображения, как правило, были ограничены жизнеспособности эксплантированной ткани в увлажненной камере поверх стандартного микроскопа. Трудности в поддержании оптимальных условий для роста культуры в отношении влажности и температуры разместил пределы от длины экспериментов визуализации. Микроскоп интегрированы в модифицированной культуры ткани инкубатора обеспечивает отличные условия для долгосрочного проживанию изображений. В этом методе мы продемонстрируем, как создать эмбриональные мышиные кохлеарные эксплантов и как использовать инкубатор микроскоп для проведения промежуток времени томографовнг с использованием как яркий поле и флуоресцентной микроскопии для изучения поведения типичного эмбриональных день (E) 13 кохлеарной эксплантата и Sox2, маркера из prosensory клеток улитки, в течение 5 дней.
Introduction
Улитка млекопитающих является весьма приказал сложный орган. В мыши, между появлением примитивного внутреннего уха из слухового пузырька на день E11 и завершения программы развития на ранних этапах постнатального развития, множественные волны клеточной сигнализации и скоординированные изменения в экспрессии генов происходят. Запуск от основания к вершине из канала улитки звук обнаружения сенсорного эпителия, или орган Корти. Развитие органа Корти изысканно управляется таким образом, что к концу развития, он будет состоять из одного ряда внутренних волосковых клеток, три ряда наружных волосковых клеток перемежаются с пятью рядами поддерживающих клеток (два ряда столбов клеток, три Ряды клеток Дейтерса) 1. Отклонение от этой точных результатов порядка в потере слуха, heighlighting важность studye OFTHE генезиса и паттерна сенсорного epithemlium 2.
В пробирке культивирования эмбриональных Кок мышиЛеа является важным инструментом в изучении механизмов развития органа Корти. Эта техника была создана в 1974 году и в течение последних 40 лет, был использован для выяснения многих механизмов, посредством которых сенсорная эпителий указанных и орган Корти, установленных 3. Улитка представляет собой сложный орган с динамическими процессами развития; манипуляция может занять до семи дней, чтобы проявить 1. Например, при добавлении ингибиторов GSK 3β, чтобы кохлеарного культуры эксплантов на E13, оптимальный период инкубации наблюдать надежный эффект соединения составляет шесть дней 4.
Живая визуализация развивающихся улитки позволяет расследование изменений в морфологии органа Корти, изменения в экспрессии генов, отслеживание мигрирующих, пролиферирующие или умирающие клетки, и это позволяет в режиме реального времени наблюдать за результатами фармацевтических средств и нарушение сигнализации Пути. До сих пор не живут изображений улиткив основном были выполнены с помощью конфокальной микроскопии для изображения небольших участков органа Корти на короткие периоды времени 5-8, но эта техника имеет ограничения, связанные с эксплантата жизнеспособности. В визуализации эффектов долгосрочных манипуляций на медленных процессов развития, охраны окружающей среды визуализации имеет решающее значение. Обычно конфокальной системы живой визуализации использует увлажненный пластиковую коробку, которая сидит на микроскоп. Жара и влажность могут уйти через зазоры в инкубации поле, где она встречается со стола микроскоп, через окна доступа, через шарнирных отверстий и через зазоры вокруг различных частей microscope- такие как цель или источника света. Это не является оптимальным для поддержания здоровых эксплантов в течение более двух-трех дней.
Мы определяем «инкубатор микроскоп" в виде перевернутой буквы микроскопом запечатанном внутри стандартного CO 2 инкубаторе, а не инкубатор построен вокруг микроскопа. Инкубатор микроскоп эксимеет тенденцию жизнь эксперимента таким образом, что вместо того, визуализации в течение двух или трех дней, образцы могут быть отображены на срок до двух недель. Инкубатор микроскоп дает прекрасную среду для роста и дифференцировки клеток, с минимальным нарушением чтобы эксплант культур и стандартные контролируемых условиях. В исследованиях, которые проводятся в течение нескольких дней он является общим прибегать к образцам изображений на ежедневной основе, удаляя их из инкубатора и проведение их в перевернутом флуоресцентным микроскопом. Хотя такой подход может работать, как вынуть посуду из инкубатора наносит нагрузку на чувствительной развивающейся ткани. Изменения в кислотности среда для культивирования и колебаний температуры за счет удаления из инкубатора может привести к нерациональному развития и нездоровой ткани. Визуализация и ту же область, в то же фокальной плоскости, и в той же ориентации на каждый момент времени является чрезвычайно сложной задачей. С помощью автоматизированной системы в термостате, можно поддерживать здоровымткани, для сбора изображений в несколько моментов времени, и чтобы гарантировать, что тот же площадь захватывается в каждом кадре. В последние годы были разработаны несколько интегрированных инкубаторов микроскоп ткани, они были полезны не только в клинической практике 9, но и в стволовых клеток и рака исследований 10,11.
Здесь мы приводим протокол для долгосрочного живого изображения эмбриональных мыши кохлеарных эксплантов. Мы используем автоматизированную систему микроскопии внутри стандартного CO 2 инкубаторе, который имеет возможность захвата изображения нескольких образцов в точках заданного времени. Система состоит из инвертированного микроскопа, установленного внутри инкубатора. Образцы помещают во вращающийся возвышении, что дает возможность получить изображение из нескольких выборок в каждой временной точке. Освещение, захват изображения, и вращение помоста контролируются автоматизированной системы, работающей с помощью программного обеспечения Metamorph. Установив подпрограмму обработки изображений с помощью программного обеспечения мы можем установить эксперимент запустить до TWуплотнительные недели с минимальным вмешательством человека. В этом примере мы используем как яркий поле и флуоресценции, чтобы показать рост крупномасштабной и перегруппировку улитки, и, в частности, в prosensory регион. В этом эксперименте, cochleae будет расчленена из репортеров мышей Sox2 EGFP на эмбриональное день E13. Культур в пробирке будет создан, а затем изображается в течение пяти дней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько технических моментов, чтобы рассмотреть, когда культуры устанавливаются и в создании покадровой микроскоп для того, для долгосрочного изображений.
Мы используем базальной мембраны матрицу в качестве субстрата для культивирования кохлеарные эксплантов…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Спасибо Вилли ВС для оказания технической помощи и доктора Криса Gellynck за полезные замечания и три анонимных рецензентов за их конструктивные советы. Эта работа финансировалась слуха инициативы регенерации Sunnybrook
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this | http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
|
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
|
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
|
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
|
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
|
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
|
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this | |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
|
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
|
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
|
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
|
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
|
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
|
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
|
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
|
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
Referências
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
