This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
Le apoplaste extracellulaire est un compartiment distinct dans les tissus végétaux qui se trouve en dehors de la membrane plasmique et comprend la paroi cellulaire. Le compartiment apoplastique des feuilles des plantes est le site de plusieurs processus biologiques importants, y compris la formation de la paroi cellulaire, nutriment cellulaire et l'absorption de l'eau et de l'exportation, les interactions plantes-endophytes et réactions de défense contre les agents pathogènes. Procédé infiltration-centrifugation est bien établie en tant que technique robuste pour l'analyse de la composition soluble dans l'apoplaste de diverses espèces végétales. Le fluide obtenu par ce procédé est généralement connu comme apoplaste fluide de lavage (FAE). Le protocole suivant décrit une infiltration sous vide et centrifugation procédé optimisé pour l'extraction de la FAE de Phaseolus vulgaris (haricot français) cv. Tendergreen feuilles. Les limites de cette méthode et l'optimisation du protocole pour d'autres espèces végétales sont discutés. FAE récupéré peut être utilisé dans un large éventail de expéri avalts qui visent à caractériser la composition de la apoplaste et comment il varie en fonction des espèces végétales et le génotype, développement de la plante et les conditions environnementales, ou de déterminer comment les microorganismes se développent dans apoplaste fluide et répondent aux changements dans sa composition.
Le apoplaste de la plante est l'espace intercellulaire qui entoure les cellules végétales. Ce est un environnement dynamique dans lequel de nombreux processus métaboliques et de transport ont lieu. Le composant structurel majeur de l'apoplaste est la paroi cellulaire, qui est assemblé et modifié par des enzymes, des protéines structurales et des métabolites situés dans l'apoplaste. Dans les cellules végétales saines l'apoplaste est généralement maintenu dans un état acide permettant acides aminés, des sucres et d'autres nutriments pour être importés de l'apoplaste vers le cytoplasme par H + symport 1. Pendant le transport, le saccharose, le saccharose se déplace à partir de sources photosynthétiques à travers l'apoplaste et dans le système vasculaire du phloème; saccharose est ensuite transporté par un potentiel osmotique à jour par clivage invertases apoplastiques saccharose dans les deux organes puits. Sucres et autres nutriments peuvent également être transportés vers le haut et se accumulent dans des cavités stomatiques à travers le flux de transpiration 3.
"> Le apoplaste représente aussi une niche écologique où de nombreux agents pathogènes établissent leur mode de vie parasitaire. Pathogènes végétaux bactériens ont la capacité de se multiplier à des densités élevées dans l'apoplaste, qu'ils accèdent à travers des ouvertures naturelles telles que les stomates ou par des blessures 4. La concentration de l'aminé aminés et autres composés azotés dans la tomate apoplaste ont été montrés pour être suffisante pour répondre aux besoins nutritionnels des agents pathogènes bactériens et fongiques 5,6. réponses de défense primaire vers pathogènes microbiens se produisent également dans l'apoplaste, à savoir la production d'espèces réactives de l'oxygène par les peroxydases extracellulaires . et oxydases et le renforcement de la paroi cellulaire par réticulation et callose dépôt 7 La paroi cellulaire de la plante est riche en métabolites secondaires ayant des activités anti-microbiennes, la nature biochimique de ces métabolites secondaires varie entre huit espèces.En raison de la mention ci-dessus,ed et d'autres processus, feuille apoplastique fluide contient une variété de protéines, les sucres, les acides organiques, les acides aminés, les métabolites secondaires, des métaux et d'autres cations (par exemple, Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Les concentrations de soluté dans l'apoplaste de pousses sont contrôlés en grande partie par l'équilibre des processus de transport qui se produisent entre l'apoplaste et le xylème, phloème et 9 cytoplasme. Cependant, les réactions métaboliques et la croissance microbienne ou consomment également produisent solutés apoplastiques. La composition de la apoplaste est connu pour différer entre les espèces et des génotypes végétaux et en réponse à l'évolution des conditions environnementales, y compris la lumière, de la nutrition et de stress biotiques et abiotiques neuf. En étudiant la composition de l'apoplaste et son évolution, y compris des propriétés telles que redox et le potentiel osmotique, le pH, des nutriments / la disponibilité des métabolites et les activités enzymatiques, on peut obtenir de nouvelles indications sur la façon dont les plantes repondent à leur environnement. Accord ou caractériser les changements moléculaires qui se produisent dans la solution de apoplaste est compliquée car il se agit d'un compartiment spatialement structuré et dynamique dans lequel les métabolites et / ou des ions peuvent être volatils, de passage ou associé à la paroi cellulaire et la membrane plasmique. En outre, différentes techniques d'analyse sont nécessaires pour couvrir la gamme de différents types de produits chimiques.
Pour étudier la composition de l'apoplaste soluble, habituellement liquide doit être extrait à partir du tissu. Plusieurs méthodes existent pour extraire apoplaste fluide à partir de divers tissus, y compris une méthode de bande filtrante nouvellement proposé 10, mais la méthode d'extraction plus établies pour les feuilles est infiltration-centrifugation. Cette technique a été évaluée précédemment 11-13 et Lohaus et al. 2001 14 fournir un examen approfondi de la plupart des paramètres techniques de la méthode. Comme son nom l'indique, l'infiltration-centrifugation technique est un procédé en deux étapes qui implique essentiellement le remplacement de la lame d'air apoplastique avec un fluide d'imprégnation aqueuse qui se mélange avec le fluide apoplastique natif, suivie de la récupération de l'infiltration / apoplastique mélange fluide par centrifugation douce des feuilles. Comme le fluide récupéré est dilué et ne contient pas tous les composés présents dans le apoplaste (voir ci-dessous), ce fluide est communément connu comme apoplaste fluide de lavage (FAE), ou liquide de lavage parfois intercellulaire, plutôt que fluide apoplastique. La technique infiltration-centrifugation est facilement évolutive permettant échantillons individuels ou communs de la FAE de volume suffisant pour être générées et soumises à un large éventail de techniques biochimiques et d'analyse en aval (par exemple, électrophorèse des protéines, mesure de l'activité enzymatique, RMN, de nombreux types de chromatographie et de masse Spectrométrie). Feuille FAE est également utile comme apoplaste imitant milieu de croissance pour l'étude de l'interaction de la plante colonisatrice microbes esprith leur environnement 5.
Dans les protocoles suivants, nous décrivons comment effectuer la technique infiltration-centrifugation en utilisant Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen feuilles, et donner quelques exemples d'analyses en aval avec un accent sur la métabolomique. Fait important, les méthodes pour évaluer la qualité de la FAE sont fournis ainsi que des conseils pour optimiser la procédure de différents types de feuilles.
Optimisation de la source de tissu végétal
La variation biologique et technique peut être important lors de l'exécution apoplaste extractions, donc un flux de travail hautement normalisé est utile d'augmenter la continuité à travers des expériences (Figure 1). Fait important, la source de tissu végétal doit être étalonnée, y compris le type de la feuille, l'âge de la feuille, / conditions d'environnement de croissance et de l'heure du jour (tableau 1). De grandes différences existent dans la facilité avec laquelle les différentes feuilles sont infiltrés et la FAE ensuite récupérées par centrifugation; ces différences sont en corrélation avec le nombre de stomates, taille de l'ouverture et de la résistance mésophylle 12,14. Même parmi les différents cultivars de P. vulgaris il ya de grandes différences dans la facilité et le rendement de la procédure d'extraction de la FAE; par exemple les feuilles de la variété Tendergreen utilisée ici se prêtent davantage à l'extraction de la FAE en utilisant cette méthode que le cultivar de Wonder canadienne. DansP. vulgaris les premières vraies feuilles sont le plus grand et le plus facile à infiltrer, ce qui en fait le choix évident pour les extractions apoplastiques. Le volume de l'air et de l'eau apoplastique a été montré à varier avec l'âge des feuilles chez plusieurs espèces conduisant à des différences dans la FAE extractibilité 12,14. Dans P. vulgaris, vieilles feuilles deviennent beaucoup plus difficiles à infiltrer et de produire moins de la FAE lors de la centrifugation; donc feuilles ont été récoltés quand ils ont atteint pleine expansion. Les feuilles qui sont difficiles à infiltrer nécessitent des vitesses de centrifugation plus élevés pour récupérer la FAE suite. Il faut donc dépister attentivement plusieurs types de feuilles différentes et variétés avant de décider d'une source de tissu pour les extractions de la FAE à grande échelle.
conditions de croissance des plantes doivent également être normalisés autant que possible dans le contexte de l'expérience. L'utilisation d'armoires de croissance est préférable car ils permettent l'humidité constante, la température et lighrégiments t intensité pour être maintenues. La récolte des feuilles doit toujours se produire au même moment de la journée parce que les concentrations de métabolites, des enzymes, etc. varient tout au long du cycle diurne 14. Enfin, pour se assurer que l'usine laisse tous ont la pression de turgescence similaire, les plantes doivent être arrosées dès avant (~ 1 h) la récolte.
Optimisation de l'infiltration et de centrifugation à lame
Cytoplasmique contamination indésirable de la FAE due à la lyse de la cellule partielle en résultera si les contraintes mécaniques rencontrées par les cellules est trop élevée au cours des étapes de centrifugation ou infiltration. Par conséquent, la procédure pour un type de feuille donnée devrait être un compromis optimisé entre la maximisation de rendement et minimiser la contamination cytoplasmique de la FAE. Dans tous les cas, il faut utiliser la plus basse vitesse de centrifugation à laquelle la FAE peut être récupéré afin d'éviter toute rupture mécanique des cellules de la feuille. Optimisation de la centrifugation de vitesse doit être déterminée de manière empirique pour chaque type de feuille en surveillant le volume récupéré et apoplaste contamination sur une plage de vitesses de centrifugation. Il a été observé que les activités enzymatiques marqueurs, tels que MDH, G6PDH et le glucose-phosphate isomérase, reste faible jusqu'à ce qu'une force centrifuge de seuil est dépassé, au-dessus duquel ces activités augmentent rapidement, probablement en raison de fuites cytoplasmique 9,12,14. L'utilisation de Parafilm pour le soutien lors de l'étape de centrifugation, comme indiqué par Baker et al. 2012 11, peut améliorer l'efficacité de l'extraction de la FAE et peut minimiser les dommages mécaniques à la lame de feuilles causé par pliage excessif et compression. En outre, l'utilisation de Parafilm améliore la visualisation de la feuille après centrifugation quand il convient d'examiner la feuille pour les dommages et l'exhaustivité de l'extraction de la FAE.
Nouchi 12 décrire l'optimisation de la récupération de la FAE de sections de feuilles de riz de coupe, qui sont difficult pour infiltrer et nécessitent des vitesses de centrifugation élevée, pour recueillir la FAE en raison de leurs petites ouvertures stomates. L'amélioration de mouillage de la surface des feuilles de riz, soit par pré-trempage des feuilles dans de l'eau distillée ou de l'addition d'un tensioactif au liquide d'infiltration, facilité le processus d'infiltration. Une vitesse de centrifugation plus élevé (6000 xg) a également été utilisé lors de contrôle de la contamination apoplastique 12. Lors de l'utilisation des sections de feuilles de coupe, il ya toujours le risque que la contamination cytoplasmique sera plus répandue, même avec un lavage poussé des sites de la plaie; feuilles coupées ne devraient donc être utilisés lorsque cela est nécessaire.
Pour beaucoup d'études de l'eau distillée est utilisée comme fluide de 11 l'infiltration. Cependant, les composés peuvent être ajoutés au fluide d'infiltration, tels que des sels ou des tampons, pour améliorer l'extraction de certains composés, en particulier les protéines apoplastiques 13. Lohaus 14 a évalué l'effet de la force ionique et osmotique on la composition de la FAE récupéré et les a jugées négligeables. Les variations de pH du milieu d'infiltration, cependant, peuvent affecter la composition de la FAE 14.
Manipulation et le stockage du fluide apoplastique extrait est important. FAE a été montré pour contenir une multitude de proteases et d'autres enzymes 13,20, ainsi que des composés organiques volatils. Par conséquent, pour réduire les changements à la composition de la FAE après la récupération il est recommandé de conserver des échantillons sur la glace ou autrement stockées à -80 ° C. En outre, dosages enzymatiques de la FAE doivent être effectuées dès que possible après l'extraction de limiter l'inactivation enzymatique due à la protéolyse, la dilution prolongée ou de gel-dégel.
Le processus d'infiltration dilue le fluide apoplastique et il est souvent nécessaire de déterminer l'étendue de cette dilution. L'étape de centrifugation peut aussi diluer la FAE avec de l'eau à partir des compartiments intracellulaires. Un facteur de dilution est nécessaireed pour estimer in vivo apoplaste concentrations pt produits chimiques lors de mesures sont effectuées sur la FAE. Un facteur de dilution est également nécessaire de se concentrer FAE à nouveau au complet quand il est utilisé comme un apoplaste imitant milieu de croissance pour les microbes – correspondant donc à des concentrations de métabolites in vivo aussi précisément que possible. Plusieurs variantes existent sur la méthode décrite dans l'étape 4 pour déterminer le facteur de dilution FAE en mesurant la dilution d'un composé ajouté au fluide d'infiltration du marqueur. Pour toutes les méthodes de calcul de dilution FAE suppose que le fluide d'infiltration est pas sensiblement absorbée ou dilué par les cellules de la feuille pendant le processus de récupération FAE. Cette hypothèse a été vérifiée précédemment pour l'étape d'infiltration, mais 14 ne est pas vérifiée pour l'étape de centrifugation. Le composé marqueur doit également pas être absorbé, transporté ou tout modifié dans le apoplaste. Indigo carmin est le plus largement utilisé et soigneusement testé de colorants utiliséspour la FAE calculs de dilution. Carmin d'indigo affiche une faible absorbance à la résine échangeuse de cations et des parois cellulaires isolés et se est révélé être approprié pour le calcul de la FAE dans Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum et Glycine max 11,21,22. Toutefois, dans certains types de feuilles, par exemple, le riz et le concombre, l'indigo carmin semblait ne pas être entièrement récupéré après l'infiltration, ce qui conduirait à une sous-estimation du facteur de dilution FAE 12,21. L'absence de récupération de l'indigo carmin est peut-être en raison de sa susceptibilité au clivage par l'isatine en sulfonate 23 dismutase, qui est connue pour être produite dans l'apoplaste, en particulier 24 sous contrainte. Le clivage du carmin d'indigo dans sulfonate isatine se traduira par une perte d'absorbance à 610 nm et une augmentation à 245 nm. Que cette réaction se produit dans une mesure appréciable dans l'apoplaste, ou si cette réaction peut être inhibée par l'addition d'accepteurs d'infiltrat à dismutasesfluide ionique n'a pas été étudiée à ce jour. Bleu Dextrane a été utilisé à la place de l'indigo carmin, pour la quantification du facteur de dilution du riz FAE feuilles 12, bien que sa stabilité et sa récupération dans la FAE n'a pas été signalée. En variante, les composés radio-marqués tels que [14 C] sorbitol ou d'autres normes et quantifiables internes peuvent être utilisés à la place de colorants et de la diminution de la radioactivité ou de la concentration mesurée et utilisée pour calculer le facteur de dilution d'une manière analogue 11,14,25.
Limites de la technique
Quelques mises en garde existent pour la méthode d'isolement de la FAE infiltration-centrifugation. Tout d'abord, la dilution de l'apoplaste au cours de l'infiltration peut obtenir une réponse de la plante. Si les cellules des feuilles environnantes détectent une concentration diminuée pour certains composants du fluide apoplastique, ils peuvent réagir en excréter autres métabolites, faussent l'interprétation des concentrations de métabolites. Enune évaluation de ce problème, il a été observé que ni le temps entre infiltration et centrifugation ni différences modérées de la force ionique du fluide d'infiltration affecté la composition de l'extrait FAE 14,22. Par conséquent, tous les artefacts résultant de la dilution apoplaste sont considérés comme minimes.
Un deuxième inconvénient potentiel est que l'élution de la FAE par centrifugation ne tient pas compte de toutes les molécules présentes dans l'apoplaste pour plusieurs raisons. Certains composés, en particulier les cations et les protéines peuvent être étroitement associés à la paroi cellulaire chargée négativement et ne se éluent avec le FAE 13. D'autres molécules telles que les protéines peuvent être trop grandes pour éluer de manière efficace hors de l'apoplaste aux vitesses de centrifugation 14 utilisés. Espèces réactives de l'oxygène sont une classe importante de composé produit dans l'apoplaste, mais en raison de la nature éphémère de ces composés, et les exigences non précisées pour leur production, leur presence ne est pas bien capturé par extraction de la FAE. On ne sait pas exactement comment la FAE représente la composition in vivo du fluide de apoplaste et cela peut varier entre les espèces.
Plusieurs tests existent pour déterminer la contamination cytoplasmique, mais aucune ne est universellement acceptée. Les dosages d'enzymes cytoplasmiques principalement (par exemple, G6PDH, phosphate isomérase hexose, MDH) ont l'avantage d'être facile à réaliser, mais peut ne pas corréler bien avec fuites cytoplasmique 14,18. L'évaluation des métabolites cytoplasmiques (par exemple, les phosphates de hexose, chlorophylle) est peut-être plus indicatif, mais est moins bien établie 11. Néanmoins, les deux types de test peut être utile pour la quantification relative de la contamination entre les échantillons apoplastique. Idéalement, plusieurs mesures indépendantes devraient être utilisés pour valider l'intégrité de l'échantillon de la FAE.
Tout en reconnaissant ses limites, l'infiltration-centrifugatisur la technique décrite ici reste une technique simple et robuste dans l'étude des protéines, métabolites apoplastiques primaires et secondaires et des ions inorganiques.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
razor blade | Fisher | 12-640 | |
60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
vacuum source | |||
5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
indigo carmine | Sigma | I8130 | |
microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
NADH | Roche | 10128023001 | |
MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
ribitol | Sigma | A5502 | |
methanol | Sigma | 650471 | |
chloroform | Sigma | 472476 | |
vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |