Live-imaging del<em> Drosophila</em> Pupa Eye
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Processi di sviluppo inerenti pupa Drosophila possono spostare e distorcere l'epitelio occhio in modo tale da rendere il comportamento delle cellule individuali difficili da rintracciare durante l'imaging cellulare dal vivo. Questi processi comprendono: la rotazione della retina, la crescita cellulare e la circolazione organismal. Inoltre, irregolarità nella topologia dell'epitelio, compresi urti sottili e pieghe spesso introdotti come la pupa è preparato per l'imaging, rendono impegnativo per acquisire immagini in-fuoco di più di qualche ommatidi in un unico piano focale. Il flusso di lavoro delineato qui rimedi questi problemi, consentendo un facile analisi dei processi cellulari durante lo sviluppo di Drosophila pupa occhio. Pupe Opportunamente-messa in scena sono disposti in una piattaforma di imaging che può essere facilmente montato nella maggior parte dei laboratori Ubiquitin-DE-caderina. GFP e GMR-GAL4 -driven UAS-α-catenina: GFP sono utilizzati per visualizzare i bordi delle celle nell'epitelio dell'occhio 1 -3. Dopo deconvoluzione èapplicata alle immagini catturate fluorescenti a più piani focali, immagini massimi proiezione vengono generate per ogni punto di tempo e migliorate utilizzando un software di editing delle immagini. Algoritmi di allineamento vengono utilizzati per stabilizzare rapidamente il movimento superfluo, rendendo il comportamento delle cellule individuali più facile tenere traccia.
Introduction
Il composto Drosophila occhio è caratterizzato dalla disposizione dei suoi stereotipo ~ 750 ommatidi separati da un reticolo a nido d'ape di cellule pigmentate accessorie 4,5. Queste cellule del pigmento sono modellati da una combinazione coordinata di eventi: i movimenti delle cellule locali, la crescita delle cellule, cambiamenti di forma delle cellule e l'apoptosi. Visualizzazione diretta di questo epitelio permette di studiare i meccanismi molecolari alla base di questi eventi in un contesto tridimensionale fisiologicamente rilevanti e imperturbabile.
Diversamente dai precedenti protocolli 6,7, la tecnica qui delineato incorpora un metodo efficace per stabilizzare il movimento del tessuto estraneo che non può essere disaccoppiato dal processo di imaging. Questo metodo migliora studi di comportamento delle cellule in via di sviluppo Drosophila pupa occhio epitelio – un tessuto che cresce, ruota e si sposta nel corso di imaging. Inoltre, il movimento di stabilizzazione technique dedescritto qui sarà utile per studiare le cellule in altri contesti in cui si verifica il movimento estraneo.
Per visualizzare i bordi delle celle nel campo della retina Drosophila, linee mosca transgenici sono stati generati che esprimono ubi-DE-caderina: GFP e UAS-α-catenina: GFP sotto il controllo del driver specifico-eye GMR-GAL4 1-3. L'uso di due marcatori di membrana GFP-tag permette la visualizzazione dei bordi delle celle a luce minore intensità. Questo riduce al minimo i danni ai tessuti e photobleaching esposizione ripetuta a lunghezze d'onda ad alta energia, che consente una maggiore frame rate e la durata del filmato. Per migliorare l'efficacia dei transgeni RNAi, UAS-DCR-2 è stato anche inserito in una seconda linea di volo 8.
In un terzo aggiornamento da protocolli precedenti, un impianto di imaging semplice che può essere facilmente montato in maggior parte dei laboratori è descritto. Questo apparecchio evita la necessità di avere un dell'imaging r specializzataig generato da 'officina' di un'università o di un servizio simile. Questo impianto di imaging è simile a quella utilizzata per immagine altri tessuti pupa 9,10.
Presentato qui è un semplice protocollo live-cell imaging che può essere utilizzato per valutare direttamente gli eventi morfogenetici che contribuiscono a patterning occhio da ~ 17-42 ore dopo la formazione puparium (hr APF). In particolare, questo protocollo permette di determinare le conseguenze di modificare l'espressione genica durante lo sviluppo pupa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La descrizione di wild-type sviluppo (sopra) costituisce la base per il confronto di eventi patterning in RNAi o genotipi iperespressione. Confronti di sviluppo del tessuto vivo hanno un valore inestimabile per determinare con precisione quali comportamenti cellulari sono regolati da una proteina di interesse. Inoltre, e non qui descritte, l'imaging cellulare dal vivo permette di fare descrizioni qualitative e / o quantitative del ruolo di un gene di interesse negli eventi che motivo l'occhio. In 30-32 ore APF m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Referências
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