Live-הדמיה של<em> דרוזופילה</em> גלמי עין
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
תהליכים מובנים של פיתוח גלמי תסיסנית יכולים להזיז ולעוות את האפיתל עין בדרכים שהופכות את התאים בודד התנהגות קשה לעקוב אחר במהלך הדמיה תא חי. תהליכים אלה כוללים: סיבוב ברשתית, צמיחת תאים ותנועת האורגניזם. בנוסף, אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות ועדינות קפלים לעתים קרובות הוצגו כגולם מוכן להדמיה, לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של יותר מכמה האומטידיה במישור מוקד אחד. העבודה המתוארת כאן תרופות נושאים אלה, המאפשר ניתוח קל של תהליכים תאיים במהלך התפתחות העין גלמי דרוזופילה. גלמים כראוי מבוימים מסודרים במתקן הדמיה שניתן להרכיב בקלות ברוב המעבדות יוביקוויטין-DE-Cadherin:. GFP וGMR-GAL4 -driven UAS-α-קטנין: GFP משמשים כדי לחזות גבולות תא באפיתל העין 1 -3. לאחר deconvolution הואפנה לתמונות ניאון שנתפסו במטוסי מוקד מרובים, תמונות הקרנה מקסימליים נוצרות עבור כל נקודת זמן ומשופרת באמצעות תוכנת עריכת תמונות. אלגוריתמי יישור משמשים לייצוב תנועה מיותרת במהירות, מה שהופך קלה יותר בודדת התנהגות תא כדי לעקוב אחר.
Introduction
מתחם עין תסיסנית מאופיינת בהסדר הסטריאוטיפי של ~ 750 האומטידיה מופרדת על ידי חלת דבש-סריג של תאי פיגמנט אבזר 4,5. תאי פיגמנט אלה הם בדוגמת ידי שילוב מתואם של אירועים: תנועות תא מקומיות, צמיחת תאים, שינויים בצורת תא, ואפופטוזיס. הדמיה חיה של אפיתל זה מאפשר לאדם לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים אלה בהקשר תלת ממדים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומוטרד.
בניגוד לפרוטוקולים קודמים 6,7, הטכניקה המתוארת כאן משלבת שיטה יעילה לייצוב תנועת רקמות זרות שלא יכול להיות מנותק מתהליך ההדמיה. שיטה זו משפרת את המחקרים של התנהגות תא באפיתל פיתוח תסיסנית העין גלמים – רקמה שגדלה, מסתובבת, ומשמרות במהלך ההדמיה. בנוסף de טכניקת תנועה-ההתייצבותscribed כאן יהיה שימושי לחקר תאים בהקשרים אחרים שבם תנועה זרות מתרחשת.
כדי להמחיש את גבולות תא בתחום רשתית דרוזופילה, קווים לטוס מהונדסים נוצרו המבטאים UBI-DE-Cadherin: GFP, כמו גם UAS-α-קטנין: GFP בשליטה של נהג עין ספציפית GMR-GAL4 1-3. השימוש בשני סמני קרום מתויג GFP מאפשר ההדמיה של גבולות תא באור בעוצמה נמוך יותר. זה ממזער את הנזק וphotobleaching רקמה בחשיפה חוזרת ונשנית לאורכי גל באנרגיה גבוהה, במסגרת שיעור מוגברת המאפשר ומשך סרט. כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-DCR-2 שולב גם לקו זבוב שני 8.
בעדכון שלישי מפרוטוקולים קודמים, מתקן הדמיה פשוט שמורכב בקלות ברוב המעבדות מתואר. מנגנון זה מבטל את הדרישה ליש לי r הדמיה מיוחדIG שנוצר על ידי 'חנות המכונה "של אוניברסיטה או שירות דומה. אסדת הדמיה זו דומה לזה המשמש לרקמות גלמים אחרות תמונת 9,10.
מוצג כאן הוא פרוטוקול הדמיה פשוט לחיות תאים שיכולים לשמש כדי להעריך באופן ישיר את אירועי המוךפו"גנטי שתורמים לדפוסי עין מ~ 17-42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF hr). באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר לאדם לקבוע את ההשלכות של שינוי ביטוי גנים בזמן התפתחות גלמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תיאור התפתחות wild-type (לעיל) מהווה את הבסיס להשוואות של אירועי דפוסים בRNAi או גנוטיפים ביטוי יתר. השוואות של פיתוח רקמת חיה הן לא יסולא בפז בעת קביעה בדיוק אילו התנהגויות תא מוסדרות על ידי חלבון של עניין. יתר על כן, ולא תאר כאן, הדמיה תא חי מאפשרת לאדם להפוך את התיאורים איכ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Referências
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
