مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em> في فيفو</em> التصوير الضوئي
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
وقد تم التحقيق بشكل مكثف الجسيمات الشحمية وبمثابة واحدة من نظم لتقديم الأدوية الطبية الحيوية الأكثر حيويا لتطبيقات سريرية 1،2. وهي تتألف أساسا من الدهون الفوسفاتية والكوليسترول، وكلاهما مركبات حيويا محاكاة أجزاء من أغشية الخلايا الطبيعية. في حين أن المواد المائية يمكن شرك في المناطق الداخلية مائي، يمكن إدراجها كلاء محبة للدهون داخل طبقة ثنائية فسفوليبيد liposomal 3. تغليف المواد داخل الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية يمنح الحماية ضد تدهور في الجسم الحي، وكذلك يمنع النظام المضيف من التأثيرات السامة للأدوية السامة للخلايا المستخدمة في العلاج من الأمراض، لمبحث المعالجة الكيميائية المثال تهدف إلى تدمير الخلايا السرطانية. تعديل سطح liposomal مع البوليمرات مثل polyethylenglycol (من مضاد) يمتد مزيد من الوقت تداول liposomal الدم في الجسم الحي بسبب الاستقرار sterical 4. Moreovإيه، يمكن أن الجسيمات الشحمية بتنحية تركيزات عالية من العديد من المواد مثل البروتينات 5،6، 7،8 المواد المائية والإنزيمات 9. ولأنها تخدم الأدوات العلاجية والتشخيصية السريرية موثوق بها والتي تستحق موافقتهم على تسليم الأدوية السامة للخلايا مثل دوكسوروبيسين لعلاج السرطان 4. نظرا لمرونتها، الجسيمات الشحمية يمكن أيضا أن تكون محملة fluorochromes لأغراض الجراحية التشخيصية وموجهة الصورة.
يوفر التصوير مضان فعالة من حيث التكلفة وغير الغازية في أداة تشخيصية الجسم الحي والتي مع ذلك، يطالب بعض المتطلبات الأساسية. يمكن أن ثبت أن fluorochromes التي تتناسب بشكل افضل للتصوير في الجسم الحي يكون امتصاص مميزة والحدود القصوى للانبعاثات في النطاق حيث تشتت الضوء ونثر وكذلك تألق ذاتي الأنسجة القادمة من المياه والهيموغلوبين منخفضة. وهكذا، هذه المجسات لها من ماكسيما ABS / م بين 650 و 900 نانومتر (10). وبالاضافة الى هذا، واستقرار fluorochromes سواء في التجارب المختبرية والحية أمر بالغ الأهمية، كما طهاية والتخليص السريع يمكن أن تحد كثيرا تطبيقها لفي الجسم الحي التصوير 11. آثار أخرى مثل ضعف الاستقرار وانخفاض الحساسية أو آثار السامة للخلايا على الأعضاء المستهدفة كما رأينا مع الأخضر الإندوسيانين (ICG) 12-16، وغير المرغوب فيها ويجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم تحقيقات للتصوير في الجسم الحي. وقد أدت هذه الملاحظات إلى التنمية النشطة العديد من fluorochromes NIR قبل السريرية، الجسيمات النانوية وكذلك تقنيات جديدة للتصوير في الجسم الحي من عمليات التهابات والسرطان وللصورة موجهة جراحة 17-20. وعلى الرغم من استقرار معظم (مضان بالقرب من الأشعة تحت الحمراء) NIRF قبل السريرية الأصباغ في المختبر، نضح السريع والتخليص من خلال الكبد والكلى تعوق استخدامها في التصوير في الجسم الحي البصري للأمراض والعمليات الالتهابية.
ntent "> ونحن بالتالي تقديم بروتوكول للتغليف من fluorochromes مثل تتميز كذلك بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت DY-676-COOH، والمعروف عن ميلها إلى إخماد الذاتي بتركيزات عالية نسبيا 21 في الجسيمات الشحمية. بتركيزات عالية H- تشكيل ديمر و / أو التفاعلات بين الجزيئات fluorophore تقع ضمن فورستر نتيجة دائرة نصف قطرها بعضهم البعض في فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) بين جزيئات تألقي. وفي تركيز منخفض الفضاء بين زيادات جزيئات fluorophore، وبالتالي منع التفاعل التراص PI-التراص بي و -H ديمر تشكيل ومما أدى إلى انبعاث مضان عالية، والتبديل بين تركيز عال ومنخفض والتبريد مضان المرافق وتفعيل هي استراتيجية واعدة التي يمكن استغلالها للتصوير الضوئي (22). وفي هذا الصدد، التغليف من تركيزات عالية من الصبغة NIRF DY-676-COOH في المناطق الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية هو أكثر كرة القدمvorable لفي الجسم الحي التصوير من الصبغة مجانا. التحدي المتمثل في طريقة يكمن أولا وقبل كل شيء في التغليف الصحيح وثانيا، في المصادقة على الفوائد الناتجة عن التغليف تركيزات عالية من الصبغة. وبمقارنة خصائص التصوير من الجسيمات الشحمية مروي مع أن من صبغ مجاني وأيضا مع صياغة غير مروي الحويصلية مع تركيزات منخفضة من الصبغة أمر لا غنى عنه. وتبين لنا من خلال ترطيب فيلم وقذف بروتوكول بسيط، ولكن فعالة للغاية جنبا إلى جنب مع بديلة تجميد والذوبان الدورات التي التغليف تركيزات التبريد من DY-676-COOH في الجسيمات الشحمية هو ممكن عمليا. أساليب أخرى تستخدم لإعداد الجسيمات الشحمية مثل الطور المعكوس طريقة التبخر 23 فضلا عن طريقة حقن الإيثانول 24 تمكن إعداد الحويصلية مع الكفاءة العالية التغليف لكثير من المواد المائية. ومع ذلك، فإن طبيعة المادة المراد مغلفة يمكن أن تؤثر على كفاءة التغليف. في الواقع،وترطيب الفيلم وقذف بروتوكول المقدمة هنا كشفت أعلى كفاءة لتغليف من DY-676-COOH. لتوضيح فوائد liposomal التغليف من DY-676-COOH، وهذا نموذج وذمة الناجم عن زيموزان، الذي يسمح دراسة عمليات التهابات في غضون ساعات قليلة، كانت تستخدم. هنا، ثبت أن الجسيمات الشحمية مع تركيزات عالية من مغلفة DY-676-COOH هي أكثر مناسبة للجسم كله في التصوير الضوئي الجسم الحي من العمليات الالتهابية من الصبغة مجانا أو صياغة غير مروي liposomal مع تركيزات صبغ منخفضة. وهكذا فإن البروتوكول الأساسي يوفر طريقة بسيطة وسريعة لإنتاج الجسيمات الشحمية الفلورسنت مروي والتحقق من التنشيط والتصوير إمكاناتهم سواء في التجارب المختبرية والحية.Protocol
Representative Results
Discussion
منذ الجسيمات الشحمية ويمكن أيضا أن تكون بمثابة نظم توفير الأصباغ الفلورية، وتمكين التصوير من الأمراض المستهدفة. تغليف من تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية مثل الصبغة NIRF، DY676-COOH المستخدمة هنا، يؤدي إلى ارتفاع مستوى التبريد مضان من صبغ شرك. تبريد مضان، وهي ظاهرة شهدت ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المنح الألمانية للبحوث HI-698 / 10-1 وRU-1652 / 1-1. نشكر دورين مايو للحصول على المساعدة الفنية ممتازة والشركة DYOMICS محدودة، جينا لدعمهم الرقيقة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
Referências
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. . Liposomes a practical approach. , (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Bioquímica. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging–influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
