Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em> In Vivo</em> Optical Imaging

Summary

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Abstract

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Introduction

Liposomen zijn intensief onderzocht en dienen als een van de meest biocompatibele biomedische geneesmiddelafgiftesystemen voor klinische toepassingen ^1,2. Zij bestaan ​​hoofdzakelijk uit fosfolipiden en cholesterol, die beide biocompatibele verbindingen nabootsen delen van natuurlijke celmembranen. Overwegende dat hydrofiele stoffen kunnen worden ingesloten in de waterige interieur, kan lipofiele agenten binnen het liposomaal fosfolipidedubbellaag ³ worden opgenomen. Inkapseling van stoffen in het waterige inwendige van liposomen bescherming biedt tegen afbraak in vivo en voorkomt ook het hostsysteem van toxische effecten van chemotherapie voor de behandeling van ziekten, bijvoorbeeld chemotherapeutica gericht op het vernietigen van tumorcellen. De wijziging van de liposoomoppervlakte met polymeren zoals polyethyleenglycol (PEGylering) verdere uitbreiding van de liposomaal bloedcirculatie tijd in vivo vanwege sterische stabilisatie ^4. Moreoveh, liposomen kunnen afzonderen hoge concentraties van verschillende stoffen zoals eiwitten ^5,6, hydrofiele stoffen ^7,8 en enzymen ^9. Ze dienen dan ook als betrouwbare klinische therapeutische en diagnostische instrumenten die hun goedkeuring voor de levering van cytotoxische geneesmiddelen verdienen, zoals doxorubicine voor kankertherapie ^4. Door hun flexibiliteit kunnen liposomen worden geladen met fluorochromen voor diagnostische en beeldgeleide chirurgische doeleinden.

Fluorescentiebeeldvorming levert een rendabele en niet-invasief in vivo diagnostisch hulpmiddel vereist echter een aantal fundamentele eisen. Het kan worden aangetoond dat fluorchromen die het best voor in vivo beeldvorming past hebben karakteristieke absorptie en emissie maxima in het bereik waar het licht dispersie en verstrooiing evenals weefsel autofluorescence afkomstig van water en hemoglobine is laag. Aldus dergelijke probes hun abs / em maxima tussen 650 en 900 nm ^10. Daarnaast, de stabiliteit van de fluorochromen zowel in vitro pt in vivo is kritisch, aangezien opsonisatie en snelle klaring sterk kunnen beperken hun toepassing in vivo beeldvorming ^11. Andere effecten, zoals slechte stabiliteit en een lage gevoeligheid of cytotoxische effecten op doelorganen zoals gezien met indocyaninegroen (ICG) ^12-16, zijn ongewenst en moet in aanmerking worden genomen bij het ​​ontwerpen van sondes voor in vivo beeldvorming. Deze waarnemingen hebben geleid tot de actieve ontwikkeling van verschillende preklinische NIR fluorochromen, nanodeeltjes en nieuwe technieken voor de in vivo beeldvorming van ontstekingsprocessen, kanker en voor beeldgeleide chirurgie ^17-20. Ondanks de stabiliteit van de meeste preklinische NIRF (nabij-infrarood fluorescentie) kleurstoffen in vitro, hun snelle perfusie en klaring door de lever en nieren belemmeren het gebruik bij de in vivo optische beeldvorming van ziekten en ontstekingsprocessen.

ntent "> We hebben daarom presenteren een protocol voor het inkapselen van fluorochromen zoals het goed gekarakteriseerd nabij-infrarood fluorescerende kleurstof DY-676-COOH, bekend om zijn neiging tot zelf-demping bij relatief hoge concentraties ²¹ in liposomen. Bij hoge concentraties H- dimeervorming en / of pi stapelen interacties tussen fluorofoor moleculen zich binnen elkaars Förster straal resultaat Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen het fluorochroom moleculen. Bij lage concentraties de ruimte tussen de fluorofoor moleculen toeneemt, waardoor-pi stapelen wisselwerking voorkomen en H-dimeervorming en resulteert in een hoge fluorescentie-emissie. De schakelaar tussen hoge en lage concentratie en de bijbehorende fluorescentiedoving en activering is een veelbelovende strategie die kan worden benut voor optische beeldvorming ^22. Hierbij inkapselen van hoge concentraties van de kleurstof NIRF DY-676-COOH in het waterige inwendige van liposomen is favorable voor in vivo beeldvorming dan de vrije kleurstof. De uitdaging van de werkwijze ligt allereerst in de juiste inkapseling en anderzijds in de validering van de voordelen van het inkapselen van hoge concentraties van de kleurstof. Vergelijking van de beeldvormende eigenschappen van liposomen geblust met die van de vrije kleurstof en ook een niet afgeschrikt liposoomformulering met lage concentraties van de kleurstof onontbeerlijk. We tonen door een eenvoudige maar zeer effectieve film hydratatie en extrusie protocol gecombineerd met afwisselend bevriezen en ontdooien cycli die inkapseling van uitdoving concentraties DY-676-COOH in liposomen haalbaar. Andere methoden voor het bereiden van liposomen zoals de omgekeerde fase verdamping werkwijze ²³ en de ethanol injectiemethode ²⁴ staat liposoompreparaat hoge efficiënties van inkapseling voor veel hydrofiele stoffen. De aard van de stof te kapselen kan de inkapseling efficiëntie beïnvloeden. In effect,de film hydratatie en extrusie-protocol hier gepresenteerde onthulde het hoogste rendement voor het inkapselen van DY-676-COOH. Om de voordelen van liposomale inkapseling van DY-676-COOH, een zymosan geïnduceerde oedeem model, dat de studie van ontstekingsprocessen binnen enkele uren laat illustreren, werd gebruikt. Hier wordt aangetoond dat liposomen met een hoge concentratie van het ingekapselde DY-676-COOH zijn meer geschikt voor het gehele lichaam in vivo optische beeldvorming van ontstekingsprocessen dan de vrije kleurstof of niet- afgeschrikt liposomale formulering met lage concentraties kleurstof. Dus de onderliggende protocol een eenvoudige en snelle methode om geblust fluorescerende liposomen en de validatie van de activering en imaging potentieel zowel in vitro als in vivo produceren.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures zijn goedgekeurd door de regionale dier commissie en in overeenstemming met internationale richtlijnen over de ethische gebruik van dieren. 1. Voorbereiding van de materialen en instrumenten Bereiding van spontaan gevormde vesicle dispersie (SFV) Los en worden voorraadoplossingen van de volgende fosfolipiden: 214 mg / ml ei fosfatidylcholine (EPC), 134 mg / ml cholesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn glycero-3-phosphoethanolamine- <e…

Representative Results

Het inkapselen van hoge concentraties van fluorescente kleurstoffen zoals de NIRF kleurstof DY676-COOH hier in het waterige inwendige van liposomen leidt tot een hoog niveau van fluorescentie uitdoving. Fluorescentiedoving, een fenomeen gezien met vele fluoroforen in hoge concentraties, kunnen in verschillende in vivo imaging toepassingen waar een hoge gevoeligheid en betrouwbare detectie van het doelgebied zijn opgesteld worden benut. Het gebruik van liposomen ook bescherming van de kleurstof die onmisbaar is …

Discussion

Aangezien liposomen ook kan dienen als afgiftesystemen voor fluorescente kleurstoffen, zij stellen beeldvorming van doelziekten. Het inkapselen van hoge concentraties van fluorescente kleurstoffen zoals NIRF kleurstof, DY676-COOH hier gebruikt, leidt tot een hoog niveau van fluorescentie uitdoving van de ingesloten kleurstof. Fluorescentiedoving, een fenomeen gezien met vele fluoroforen in hoge concentratie kan in verschillende in vivo beeldvormende toepassingen, waarbij een hoge gevoeligheid en betrouwbare det…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials