Fluorescence-trempe d'un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em> In Vivo</em> Imagerie optique

Summary

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Abstract

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Introduction

Les liposomes ont été intensivement étudiée et servir comme l'un des systèmes les plus biocompatibles de délivrance de médicaments pour des applications biomédicales cliniques ^1,2. Ils sont principalement constitués de phospholipides et de cholestérol, qui sont tous deux composés biocompatibles imitant des parties de membranes cellulaires naturelles. Considérant que les substances hydrophiles peuvent être piégés dans l'intérieur aqueux, agents lipophiles peuvent être incorporés dans la bicouche liposomale ^trois phospholipides. L'encapsulation de substances dans l'intérieur aqueux des liposomes confère une protection contre la dégradation in vivo et empêche également le système hôte contre les effets toxiques des médicaments cytotoxiques utilisés pour la thérapie de maladies, par exemple des agents chimiothérapeutiques visant à détruire les cellules tumorales. La modification de la surface liposomique avec des polymères comme le polyethylene glycol (pégylation) se étend en outre le temps de circulation sanguine des liposomes in vivo en raison de la stabilisation stérique ^4. Moreover, les liposomes peuvent séquestrer des concentrations élevées de plusieurs substances telles que les protéines, ^5,6 substances hydrophiles ^7,8 et ⁹ enzymes. Ils servent donc des outils thérapeutiques et diagnostiques cliniques fiables qui méritent leur approbation pour la livraison de médicaments cytotoxiques tels que la doxorubicine pour le traitement du cancer ^4. En raison de leur souplesse, les liposomes peuvent également être chargées avec des fluorochromes à usage chirurgical et de diagnostic par imagerie.

imagerie de fluorescence fournit un coût-efficace et non invasive outil de diagnostic in vivo qui, cependant, exige certaines exigences de base. Il pourrait être démontré que fluorochromes qui conviennent le mieux pour l'imagerie in vivo ont absorption caractéristique et maxima d'émission dans la gamme où la dispersion de la lumière et de diffusion ainsi que autofluorescence de tissu provenant de l'eau et de l'hémoglobine est faible. Ainsi, de telles sondes ont leurs maxima abs / em entre 650 et ¹⁰ 900 nm. En outre, la stabilité de fluorochromes la fois in vitro et in vivo est critique, opsonisation et le dédouanement rapide peuvent considérablement limiter leur application pour l'imagerie in vivo ^11. D'autres effets tels que la mauvaise stabilité et une faible sensibilité ou des effets cytotoxiques sur les organes cibles comme on le voit avec le vert d'indocyanine (ICG) ^12-16, sont indésirables et doivent être pris en considération lors de la conception des sondes pour l'imagerie in vivo. Ces observations ont conduit au développement actif de plusieurs fluorochromes NIR précliniques, des nanoparticules ainsi que de nouvelles techniques pour l'imagerie in vivo de processus inflammatoires, le cancer et pour la chirurgie guidée par l'image ^17-20. En dépit de la stabilité de la plupart (fluorescence dans le proche infrarouge) NIRF colorants préclinique in vitro, leur perfusion rapide et de la clairance par le foie et les reins empêchent leur utilisation dans l'imagerie optique in vivo de maladies et de processus inflammatoires.

MÉNAGEMENT "> Nous présentons donc un protocole d'encapsulation de fluorochromes tels que le bien caractérisé proche infrarouge colorant fluorescent DY-676-COOH, connu pour sa tendance à l'auto-trempe à des concentrations relativement élevées ²¹ dans des liposomes. A des concentrations élevées H- la formation de dimères et / ou pi-empilement interactions entre les molécules de fluorophore situées dans la suite de rayon de Förster les uns des autres dans Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) entre les molécules de fluorochrome. A faible concentration de l'espace entre les molécules de fluorophore augmente, empêchant de ce fait l'interaction de pi-empilement et H-formation de dimères et aboutissant à forte émission de fluorescence. Le commutateur entre la concentration haute et basse et la fluorescence trempe accompagnement et l'activation est une stratégie prometteuse qui peut être exploitée pour l'imagerie optique ^22. À cet égard, l'encapsulation de fortes concentrations du colorant NIRF DY-676-COOH dans l'intérieur aqueux de liposomes est plus favorable pour l'imagerie in vivo que le colorant libre. Le défi de la méthode réside d'abord dans la bonne encapsulation et d'autre part, à la validation des avantages résultant de l'encapsulation de fortes concentrations du colorant. En comparant les propriétés de formation d'image pour traitement de liposomes avec celle du colorant libre et également avec une formulation non trempé liposome avec de faibles concentrations de colorant est indispensable. Nous montrons par un protocole simple, mais très efficace hydratation du film et extrusion combinée avec le gel et de dégel des cycles alternés que l'encapsulation des concentrations de trempe de DY-676-COOH dans des liposomes est possible. D'autres procédés utilisés pour préparer des liposomes, tels que le procédé d'evaporation en phase inverse ²³ ainsi que la méthode d'injection d'éthanol ²⁴ permettent la préparation de liposomes avec des rendements élevés d'encapsulation de nombreuses substances hydrophiles. Cependant, la nature de la substance à encapsuler peut influer sur l'efficacité d'encapsulation. En effet,l'hydratation du film et de l'extrusion protocole présenté ici a révélé la plus grande efficacité pour l'encapsulation de DY-676-COOH. Pour illustrer les avantages de l'encapsulation liposomale de DY-676-COOH, un modèle de l'oedème induit par le zymosan, ce qui permet l'étude des processus inflammatoires dans les quelques heures, a été utilisé. Ici, il est démontré que les liposomes avec des concentrations élevées de la DY-676-COOH encapsulés sont plus appropriés pour le corps entier pt imagerie optique in vivo de processus inflammatoires que le colorant libre ou la formulation liposomale non trempé avec de faibles concentrations de colorant. Ainsi, le protocole sous-jacent fournit un procédé simple et rapide pour produire des liposomes fluorescents pour traitement et la validation de l'activation et leur potentiel imagerie à la fois in vitro et in vivo.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures sont approuvées par le comité régional et des animaux conformément aux lignes directrices internationales sur l'utilisation éthique des animaux. 1. Préparation des matériaux et instruments Préparation d'une dispersion de vésicules formées spontanément (SFV) Dissoudre et préparer des solutions d'achat d'actions des phospholipides suivants: 214 mg / ml phosphatidylcholine d'oeuf (EPC), 134 mg / ml de cholestérol,…

Representative Results

L'encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF DY676-COOH utilisé ici dans l'intérieur aqueux des liposomes entraîne un niveau élevé de l'extinction de fluorescence. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration, peut être exploitée dans plusieurs applications d'imagerie in vivo où une grande sensibilité et une détection fiable de la région cible sont demandés. L&#…

Discussion

Étant donné que les liposomes peuvent également servir de systèmes de délivrance pour des colorants fluorescents, ils permettent l'imagerie des maladies cibles. L'encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF, DY676-COOH utilisé ici, conduit à un niveau élevé de l'extinction de fluorescence du colorant piégé. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration peut être exploitée dans plusieu…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials