위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em> 생체</em> 광학 이미징
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
리포좀 집중적으로 연구 및 임상 응용에 가장 1,2- 생체 의용 약물 전달 시스템의 하나로서 역할을하고있다. 이들은 주로 천연 세포막의 일부를 모방하는 화합물이다 생체 둘 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다. 친수성 물질은 수성 내부에 혼입 될 수있는 반면, 친 유성 제제는 리포좀 인지질 이중층 3 내에 내장 될 수있다. 리포좀의 수성 내부 내에 캡슐화 물질의 생체 내에서 분해에 대한 보호 기능을 부여하고 또한 종양 세포 파괴를 목표로 화학 요법 제를위한 예시적인 질병의 치료에 사용되는 세포 독성 약물의 독성 효과로부터 호스트 시스템을 방지한다. 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 같은 리포솜 표면의 변형 (PEG 화)를 더 인해 sterical 안정화 (4)에 생체 내에서 리포솜 혈액 순환 시간을 연장한다. Moreov어, 리포좀 단백질 5, 6, 친수성 물질 7,8 효소 (9) 등 여러 가지 물질의 높은 농도를 격리한다 수 있습니다. 그러므로 그들은 암 치료 4 독소루비신으로 세포 독성 약물의 전달을 위해 자신의 승인을받을만한 신뢰할 임상 치료 및 진단 도구를 제공합니다. 유연성이 있기 때문에, 리포좀은 또한 진단 및 영상 유도 수술 목적의 형광체와 함께로드 될 수있다.
형광 이미징는 비용 효율적이며 그러나, 기본적인 요건을 요구 생체 진단 도구에 비 침습적. 이 생체 내 이미징을위한 가장 적합한 형광 색소가 빛을 분산 및 산란뿐만 아니라 물에서 발생하는 조직의자가 형광과 헤모글로빈이 낮은 범위의 특성 흡수 및 배출 최대 값이 있는지 입증 할 수있다. 따라서, 이러한 프로브는 650 nm의 10 (900) 사이에서 자신의 복근 / EM 최대 값을 가지고있다. 옵 소닌과 신속한 간극이 크게 생체 내 이미징 (11)을위한 그들의 적용을 제한 할 수 있으므로,이 외에, 시험 관내 및 생체 내 형광 색소의 안정성이 매우 중요하다. 불량한 안정성과 낮은 감도 또는 인도 사이 아닌 그린 (ICG) 12-16으로 볼 때 표적 장기에 세포 독성 효과와 같은 다른 효과는 원치 않는이며, 생체 내 이미징 프로브를 설계 할 때 고려되어야합니다. 이러한 관찰은 여러 임상 근적외선 형광 색소, 나노 입자뿐만 아니라 염증 반응, 암의 생체 내 이미징 및 영상 유도 수술 17 ~ 20를위한 새로운 기술의 적극적인 개발을 주도했다. 대부분의 전임상 NIRF (근 적외 형광)의 안정성에도 불구 염료 시험관, 간과 신장을 통해 빠르게 관류 및 클리어런스가 질환 및 염증 과정의 생체 내 이미징 광학의 사용을 방해.
ntent은 "> 따라서 우리는 다음과 같은 형광 색소의 캡슐화 프로토콜을 제시 잘 특징 근적외선 리포좀에 상대적으로 높은 농도 (21)에 자기 담금질에 그 경향이 알려져 형광 염료 DY-676-COOH. 높은 농도에서 H- 이량 체 형성 및 / 또는 파이 – 적층, 형광 분자 증가 사이 저농도. 스페이스를 형광 색소 분자 사이 포스터 공명 에너지 전이 (FRET)에 서로 포스터 반경 결과에 위치한 형광 분자 사이의 상호 작용을함으로써, 파이 – 스태킹 상호 작용을 방지하고 H-이량 체 형성 및 높은 형광 방출의 결과. 높고 낮은 농도 및 첨부 형광 소광 및 활성화 사이의 스위치는 광학 영상 (22)에 대해 이용 될 수 유망한 전략이다. NIRF 염료 고농도의 이러한 관점에서, 캡슐화 리포좀의 수성 내부에서 DY-676-COOH 더 파이다무료 염료에 비해 생체 내 이미징 vorable. 방법의 과제는 높은 농도의 염료를 캡슐화 인한 이득의 검증에서, 둘째 올바른 밀봉에 우선하고있다. 염료의 농도가 낮은 비 켄칭 리포솜 제형으로도 자유 염료의 켄칭 리포좀의 결상 특성을 비교하는 것은 필수적이다. 우리는 리포좀의 DY-676-COOH의 담금질 농도의 캡슐화가 가능하다 대체 동결 및 해동 사이클과 함께 간단하지만 매우 효과적인 필름 수화 및 압출 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 역상 증발 법 (23)뿐만 아니라, 에탄올 주입법 24 리포좀을 제조하는데 사용하는 다른 방법은 많은 친수성 물질에 대한 높은 캡슐화 효율이 리포좀 제제를 사용. 그러나, 물질의 성질은 포위 효율에 영향을 미칠 수있는 캡슐화. 사실상여기에 제시된 필름 수화 및 압출 프로토콜은 DY-676-COOH의 캡슐화 가장 높은 효율을 밝혔다. 몇 시간 내에 염증 과정의 연구를 허용 DY-676-COOH, 자이 모산 – 유도 부종 모델의 리포좀 캡슐화의 장점을 설명하기 위해 사용되었다. 여기서, 캡슐화 DY-676-COOH 고농도 리포좀은 자유 염료 또는 낮은 염료 농도 비 켄칭 리포좀 제형보다 염증 과정의 생체 내 광 이미징 전신에 더 적합하다는 것을 입증한다. 따라서 기본 프로토콜은 형광 켄칭 리포좀 시험 관내 및 생체 내 활성 및 그들의 촬상 전위의 유효성을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공한다.Protocol
Representative Results
Discussion
리포좀은 또한 형광 염료 전달 시스템에 대한 역할을 할 수 있기 때문에, 그것들은 대상 질환의 촬상을 가능하게한다. 이러한 NIRF 염료, 여기서 사용 DY676-COOH, 형광 염료 등의 고농도의 캡슐화는 포획 염료의 형광 소광의 하이 레벨로 이끈다. 형광 급냉, 고농도로 많은 형광체와 함께 볼 현상은 대상 영역의 높은 감도 및 신뢰성있는 검출이 요구되는 생체 내 이미징 애플리케이션에서 여…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 독일 연구 협회의 HI-698 / 10-1 보조금과 RU-1652 / 1-1에 의해 지원되었다. 우리는 우수한 기술 지원과 종류의 지원에 대한 회사 DYOMICS GmbH에, 예나에 대한 도린 월 감사합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
Referências
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