و، حزمة برمجيات المصدر المفتوح القائمة على MATLAB، plusTipTracker، ويمكن استخدامها لتحليل سلسلة صورة-fluorescently المسمى + نصائح لقياس ديناميات أنيبيب.
أنيبيب (MT) زائد تتبع نهاية البروتينات (+ نصائح ل) تعريب لتزايد بالإضافة إلى الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف وتنظيم ديناميات MT 1،2. واحدة من النصائح الأكثر معروفة وتستخدم على نطاق واسع + لتحليل ديناميات MT-ملزم هو نهاية البروتين، EB1، الذي يربط جميع MT زائد نهايات المتزايد، وبالتالي، هو علامة لMT البلمرة 1. وقد استخدمت العديد من الدراسات من السلوك EB1 داخل مخاريط النمو تستغرق وقتا طويلا وبمساعدة الحاسوب متحيزة وطرق ناحية تتبع لتحليل فردي النظام التجاري المتعدد الأطراف 1-3. نهجنا هو قياس المعلمات العالمية لديناميات MT باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد اكتساب عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج هو ومفتوحة المصدر، حزمة سهلة الاستعمال تستند MATLAB الذي يجمع بين الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام plusTipTracker لتحليل + المذنبات TIP fluorescently المسمى في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا البرنامج لوصف ديناميات MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8.
الهدف من هذه الطريقة هو الحصول على المعلومات الكمية المتعلقة أنيبيب (MT)، بالإضافة إلى تتبع نهاية البروتين (+ TIP) ديناميات يعيشون في مخاريط النمو. MT + النصائح هي مجموعة من البروتينات التي لتوطين زائد الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف 9،10. أنها تؤدي مجموعة من الوظائف لتنظيم المعلمات من عدم الاستقرار الديناميكي MT 11، بما في ذلك معدلات البلمرة، كارثة، والإنقاذ. واحد الطريقة المستخدمة جيدا لتحليل ديناميات MT هو تتبع سلوك EB1 TIP +، الذي يربط خصيصا لتزايد MT زائد 1،12 ينتهي. ومن المعروف EB1 لتجنيد عدة بروتينات أخرى لتزايد MT زائد ينتهي 13،14، ومؤخرا تم تأسيس كعامل MT النضج 15، وتعزيز كلا MT النمو وتردد كارثة 15،16.
وقد استخدمت العديد من الدراسات ديناميات MT داخل مخاريط النمو طرق ناحية تتبع لقياس التغيرات في ديناميات EB1-GFP مع مرور الوقت 1-3، وEB1 localizatiإلى MT زائد نهايات يمكن أن تستخدم كعلامة للMT البلمرة. ومن المزايا الرئيسية لدراسة المذنبات EB1-GFP كبديل للنمو MT هي أن ديناميات MT يمكن قياسها حتى في مناطق التداخل MT كبير. في حين أن طريقة المذنبات EB1-GFP تتبع ناحية قدمت معلومات مفيدة إلى MT السلوكيات 1-3، فمن وقتا طويلا ويمكن أن يكون متحيزا. بالإضافة إلى ذلك، كما هي السلوكيات الشاذة النمو مخروط الأرجح نتيجة التحولات الدقيقة في ديناميات هيكل الخلية وتحليلها فقط مجموعة فرعية صغيرة من النظام التجاري المتعدد الأطراف (عادة اللازمة عند اليد تتبع) قد يغيب عن معلومات مهمة.
وبالتالي، فإننا قياس المعلمات ديناميات MT العالمية باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker 4، بعد الحصول على عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني 5. هذا البرنامج، وضعت في مختبر Danuser، وقد استخدم في العديد من الدراسات التي تميز ديناميكية MT في مختلف أنواع الخلايا 6-8. وهو مفتوح المصدر، لنادية إيه، الحزمة استنادا MATLAB التي تشمل الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. وهناك قائمة طويلة من تحسب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة هي MT مسار النمو سرعة (في / ميكرون دقيقة)، مسار النمو عمر (ثانية)، وطول مسار النمو (في ميكرون). البرنامج يمكن تحميلها مباشرة من موقع Danuser مختبر (تحت "البرنامج"). في حين مختبر Danuser تدعم حاليا واجهة تعليقات أحدث ل + تحليل تتبع TIP، والتي يتم تضمينها في حزمة البرمجيات دعا يو المسار 2.0، ستبقى الأصلي، قائمة بذاتها البرمجيات المتاحة. خوارزميات الكامنة بين البرنامجين هي نفسها (على الأقل عام 2014)، مع وجود اختلاف في واجهة وتحليل النواتج. بالنسبة للمستخدم المبتدئ مع قليل MATLAB و / أو تحليل الحسابية جتربةسينعقد، plusTipTracker ديه المزيد من الميزات سهلة الاستخدام، بما في ذلك الآلية مخرجات المعلمة الإحصائية.
هنا، نحن تصف الخطوات لتحليل الصور من ديناميات EB1-GFP في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. تم استخدام هذا البروتوكول في ورقة حديثة دراسة ديناميات MT 17. انظر أيضا لوري وآخرون 2012 5 للحصول على تعليمات مفصلة عن مخاريط النمو زراعة معربا عن EB1-GFP. في حين أن هذه الورقة تركز في المقام الأول على دراسة ديناميات EB1-GFP في مخاريط النمو، نفس البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع الخلايا الأخرى 17. لجميع أنواع الخلايا، يجب أن يكون الفاصل الزمني بين الإطارات بين 0.5-2 ثانية لتتبع الأمثل + TIP. فترة زمنية تصل إلى 4 ثواني بين الإطارات هو ممكن، ولكن هذه النتائج زيادة الفاصل الزمني في تتبع أخطاء إضافية.
يوفر PlusTipTracker واضحة، واجهة المستخدم الرسومية بسرعة وتلقائيا للكشف مرئية تقريبا جميع المذنبات EB1-GFP في زنزانة أو النمو مخروط، ربط المذنبات في المسارات، وحساب المعلمات MT. وذكرت وغيرها من المطبوعات تصميم أنواع مماثلة من البرامج (على سبيل المثال، ماركس وآخرون. تستخد…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |