Met behulp plusTipTracker Software om dynamiek van microtubuli Meet in<em> Xenopus laevis</em> Groei Kegels
Summary
De MATLAB-gebaseerde, open source software pakket, plusTipTracker, kan worden gebruikt voor het analyseren afbeelding reeks van fluorescent gelabelde + tips om dynamiek van microtubuli kwantificeren.
Abstract
Microtubuli (MT) plus-eind volgen eiwitten (+ tips) te lokaliseren aan de groeiende plus-uiteinden van MT's en reguleren MT dynamiek 1,2. Een van de meest bekende en algemeen gebruikte + filtreren voor het analyseren MT dynamiek de End-bindingseiwit, EB1, waarbij alle groeiende MT plus-uiteinden bindt, en dus is een merker voor MT polymerisatie 1. Veel studies van EB1 gedrag binnen de groei kegels zijn tijdrovend en vooringenomen computerondersteunde, met de hand bijhouden methoden gebruikt om individuele MT 1-3 analyseren. Onze aanpak is om globale parameters van MT dynamiek met behulp van het softwarepakket, plusTipTracker 4, na de overname van een hoge resolutie, live beelden van gelabeld EB1 in gekweekte embryonale groei kegels 5 kwantificeren. Deze software is een MATLAB-gebaseerde, open-source, gebruiksvriendelijk pakket dat geautomatiseerde detectie, tracking, visualisatie en analyse voor films van fluorescent-gelabelde + TIP's combineert. Hier presenteren we het protocol voor het gebruik van plusTipTracker voor de analyse van fluorescent-gelabelde + TIP kometen in gekweekte Xenopus laevis groei kegels. Echter kan deze software ook worden gebruikt om MT dynamiek karakteriseren verschillende celtypen 6-8.
Introduction
Het doel van deze methode is kwantitatieve informatie over microtubuli (MT)-plus-end volgen proteïne (+ TIP) dynamiek in levende groei kegels verkrijgen. MT + TIP's zijn een groep van eiwitten die lokaliseren aan de plus-uiteinden van MT 9,10. Zij voeren een groot aantal functies om de parameters van MT dynamische instabiliteit 11, met inbegrip van de tarieven van de polymerisatie, catastrofe, en redding te reguleren. Een veel gebruikte werkwijze voor het analyseren MT dynamiek het gedrag van de + TIP EB1, dat specifiek bindt aan groeiende MT plus 1,12 details volgen. EB1 is bekend dat een aantal andere eiwitten te werven om aan de groeiende MT plus-ends 13,14, en is onlangs opgericht als een MT rijping factor 15, het bevorderen van zowel MT groei en catastrofe frequentie 15,16.
Veel studies van MT dynamiek binnen de groei kegels zijn hand volgen methoden om veranderingen in EB1-GFP dynamiek in de tijd 1-3 te meten gebruikt, zoals EB1 localizatiop MT plus-uiteinden kunnen worden gebruikt als een marker voor MT polymerisatie. Een belangrijk voordeel voor de behandeling EB1-GFP kometen als een proxy voor de MT groei is dat MT dynamiek kan worden gemeten, zelfs in regio's van belangrijke MT overlap. Hoewel de werkwijze hand bijhouden EB1-GFP kometen nuttige inzichten voorziet in MT gedragingen 1-3, is tijdrovend en kan worden voorgespannen. Bovendien, als afwijkende groei kegel gedrag waarschijnlijk het gevolg van minuut verschuivingen in het cytoskelet dynamiek, het analyseren van slechts een klein deel van de MT's (meestal nodig bij de hand-opsporing) belangrijke informatie kunnen missen.
Zo meten we globaal MT dynamiek parameters met behulp van het softwarepakket, plusTipTracker 4, na de overname van een hoge resolutie, live beelden van gelabeld EB1 in gekweekte embryonale groei kegels 5. Deze software, ontwikkeld in de Danuser Lab, is gebruikt in verscheidene studies karakteriseren MT dynamiek in verschillende celtypen 6-8. Het is een open-source, onser-vriendelijke, MATLAB-gebaseerde pakket dat geautomatiseerde detectie, opsporing, visualisatie en analyse voor films van fluorescent-gelabelde + TIP's omvat. Een lange lijst van specifieke parameters van MT dynamiek wordt berekend door deze software (zie referentie 4 voor details), maar voor de analyse van MT dynamiek in de groei kegels, de meest bruikbare parameters MT groeipad snelheid (in microns / minuut), de groei spoor Levensduur (in seconden) en de groei baanlengte (in microns). De software kan rechtstreeks vanaf de website Danuser Lab te downloaden (onder 'Software'). Terwijl de Danuser Lab ondersteunt momenteel een nieuwere interface voor + TIP bijhouden analyse, die is opgenomen in een software pakket genaamd u-spoor 2.0, de oorspronkelijke, stand-alone software zal beschikbaar blijven. De onderliggende algoritmes tussen beide programma's hetzelfde (althans 2014), met slechts een verschil interface en analyse outputs. Voor de beginnende gebruiker met weinig MATLAB en / of geautomatiseerde analyse experirentie, plusTipTracker heeft meer gebruiksvriendelijke functies, waaronder automatische statistische parameter uitgangen.
Hier beschrijven we de stappen voor het analyseren van beelden van EB1-GFP dynamiek in gekweekte Xenopus laevis groei kegels. Dit protocol werd gebruikt in een recente paper MT dynamiek 17 onderzoeken. Zie ook Lowery et al. 2012 5 voor gedetailleerde instructies over het kweken groei kegels uiten EB1-GFP. Hoewel dit document vooral gericht op EB1-GFP dynamica in groei kegels behandeling kan hetzelfde protocol worden gebruikt voor andere celtypes 17. Voor alle celtypen, moet het tijdsinterval tussen frames tussen 0,5-2 seconden voor optimale + TIP tracking. Een tijdsinterval van maximaal 4 seconden tussen frames mogelijk, maar deze verhoogde interval leidt tot extra spoorvolgfouten.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker verschaft een eenvoudige grafische user interface voor vrijwel alle zichtbare EB1-GFP kometen snel en automatisch te detecteren in een cel of groeikegel koppelen kometen in sporen en bereken MT parameters. Andere publicaties is het ontwerp van soortgelijke software gerapporteerd (bijvoorbeeld Marx et al. Ook gebruikt kwantitatieve analyse van gemerkte EB1 dynamica in groei kegels 18). Maar lijkt deze software uniek in het gemak van toegang tot, als hij vrij is te downloaden van de webs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule ‘plus-end-tracking proteins’: The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
