Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em> Xenopus laevis</em> Büyüme Konileri
Summary
MATLAB tabanlı, açık kaynak yazılım paketi, plusTipTracker, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için floresan etiketli + ipuçları görüntü serilerini analiz etmek için kullanılabilir.
Abstract
Mikrotubul (MT) artı-son-izleme proteinler (+ TIPler) MTS büyüyen artı uçlarına lokalize ve MT dinamiklerini 1,2 düzenler. MT dinamiklerini analiz etmek için en iyi bilinen ve + yaygın kullanılan ipuçları biri büyüyen tüm MT artı uçları bağlanır Sonu Binding Protein, EB1, ve böylece, MT polimerizasyonu 1 için bir göstergedir. Büyüme konilerinin içindeki EB1 davranışı bir çok çalışmalar bireysel MTlerin 1-3 analiz zaman tüketen ve önyargılı bilgisayar destekli, el-izleme yöntemlerini kullandık. Bizim yaklaşımımız, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin satın Aşağıdaki yazılım paketi, plusTipTracker kullanarak 4 MT dinamikleri küresel parametrelerini ölçmek için olduğunu. Bu yazılım floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz birleştiren bir MATLAB tabanlı, açık kaynak, kullanıcı-dostu paketidir. Burada, biz plusTipT kullanmak için protokol mevcutkültürlü Xenopus laevis büyüme konisi floresan etiketli + TIP kuyrukluyıldızların analizi için racker. Bununla birlikte, bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamiğini karakterize etmek için kullanılabilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı, kantitatif mikrotübül (MT) ile ilgili bilgi, artı sona izleme proteini (+ uç) büyüme konileri canlı dinamikleri elde etmektir. MT + ipuçları MTS 9,10 artı uçları lokalize bir protein grubudur. Onlar polimerizasyon, felakete ve kurtarma oranları dahil olmak üzere MT dinamik istikrarsızlık 11, parametrelerini düzenlemek için fonksiyonları bir dizi yapmak. MT dinamiklerini analiz etmek için bir iyi kullanılan bir yöntem büyüyen MT spesifik olarak bağlanan artı-biter 1,12 + TIP EB1, davranışlarını takip etmektir. EB1 büyüyen MT birkaç diğer proteinleri işe bilinen artı-biter MT büyüme ve afet frekansı 15,16 hem teşvik, 13,14, ve son zamanlarda MT olgunlaşma faktörü 15 olarak kurulmuştur edilir.
Büyüme konilerinin içindeki MT dinamikleri pek çok çalışma EB1 localizati gibi, zaman içinde 1-3 EB1-GFP dinamikleri değişiklikleri ölçmek için el-izleme yöntemlerini kullanmışlardırMT ile artı uçları MT polimerizasyonu için bir markör olarak kullanılabilir. MT büyüme için bir vekil olarak EB1-GFP kuyrukluyıldızların incelenmesi için bir anahtar yararı MT dinamikleri bile önemli MT örtüşme bölgelerinde ölçülebilir olmasıdır. El-izleme EB1-GFP kuyrukluyıldızların yöntemi MT yararlı açılımlar sağlamıştır iken, zaman alıcı ve önyargılı olabilir, 1-3 davranışları. Önemli bilgileri kaçırabilir Ayrıca, anormal büyüme gibi koni davranışlar olasılıkla (el-izleme olduğunda genellikle gerekli) MTS sadece küçük bir alt kümesini analiz sitosköletal dinamikleri dakika vardiya, sonucudur.
Böylece, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin kazanılmasından sonra, yazılım paketi, plusTipTracker 4 kullanarak küresel MT dinamiği parametreleri ölçmek. Danuser Lab geliştirilen bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamikleri karakterize çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu, bize bir açık-kaynaker-dostu, floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz içerir MATLAB tabanlı bir paket. MT dinamikleri belirli parametreler bu yazılım tarafından hesaplanan uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, en yararlı parametreler (mikron / dakika) MT büyüme izleme hızı vardır, büyüme parça (saniye olarak) ömür boyu, ve (mikron) büyüme hat uzunluğu. Yazılım ("Software" altında) Danuser Lab web sitesinden doğrudan indirilebilir. Danuser Lab şu anda orijinal, stand-alone yazılım mevcut kalacak bir yazılım paketi olarak adlandırılan u-track 2.0, içine dahil edilmiştir + TIP izleme analizi için yeni bir arabirimi destekler iken. İki program arasındaki temel algoritmalar arayüzü ve analiz çıkışların tek bir farkla, (en azından 2014 gibi) aynıdır. Biraz MATLAB ve / veya hesaplama analizleri tecrübeleri acemi kullanıcı içinence, plusTipTracker otomatik istatistiksel parametre çıkışlar dahil olmak üzere daha kullanıcı dostu özelliklere sahiptir.
Burada, biz kültürlü Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri görüntüleri analiz etmek için adımları açıklar. Bu protokol MT dinamikleri 17 inceleyen bir son kağıt kullanılmıştır. Ayrıca Lowery ve ark bakın. 2.012 5 EB1-GFP ifade kültürleme büyüme konileri ilişkin ayrıntılı talimatlar için. Bu kağıt öncelikle büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri incelenerek odaklanırken, aynı protokol diğer hücre tipleri 17 için kullanılabilir. Tüm hücre tipleri için, çerçeveler arasındaki zaman aralığının en uygun + TIP takip 0.5-2 saniye arasında olmalıdır. Çerçeveler arasındaki kadar 4 saniyelik bir zaman aralığı mümkündür, ancak bu ek izleme hataları zaman aralığı sonuçları artmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker hızlı ve otomatik olarak, bir hücre ya da büyüme konisinin hemen hemen tüm görünür EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve MT parametreleri hesaplamak için basit bir grafik kullanıcı arabirimi sağlar. Diğer yayınlar (. Örneğin, Marx ve ark büyüme konileri 18 etiketlendi EB1 dinamikleri de kullanılan kantitatif analiz) yazılımları benzer tipte tasarımı bildirdi. Ama bu yazılım özgürce, açık kaynak tasarlama k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule ‘plus-end-tracking proteins’: The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
