Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético In Situ Usando o método TUNEL

Resumo

Este vídeo descreve a dissecação, o processamento de tecidos, o seccionamento e a marcação TUNEL baseada em fluorescência do músculo esquelético de camundongos. Também descreve um método para análise semiautomatizada da rotulagem TUNEL.

Resumo

Terminal desoxinucleotidil transferase (TdT) trifosfato de desoxiuridina (dUTP) nick end labeling (TUNEL) é o método de usar a enzima TdT para anexar covalentemente uma forma marcada de dUTP a extremidades 3' de quebras de DNA de fita dupla e simples nas células. É um método confiável e útil para detectar danos ao DNA e morte celular in situ. Este vídeo descreve a dissecção, o processamento de tecidos, o seccionamento e a marcação TUNEL baseada em fluorescência do músculo esquelético de camundongos. Ele também descreve um método de quantificação de sinal TUNEL semi-automatizado. As características normais inerentes do tecido e as condições de processamento do tecido afetam a capacidade da enzima TdT de marcar o DNA com eficiência. O processamento de tecidos também pode adicionar autofluorescência indesejável que interferirá na detecção do sinal TUNEL. Portanto, é importante determinar empiricamente os métodos de processamento de tecidos e marcação TUNEL que produzirão a relação sinal-ruído ideal para quantificação subsequente. O ensaio baseado em fluorescência descrito aqui fornece uma maneira de excluir o sinal autofluorescente por subtração de canal digital. O ensaio TUNEL, usado com técnicas e controles apropriados de processamento de tecidos, é um método quantitativo relativamente rápido e reprodutível para detectar apoptose no tecido. Pode ser usado para confirmar danos ao DNA e apoptose como mecanismos patológicos, para identificar tipos de células afetadas e para avaliar a eficácia de tratamentos terapêuticos in vivo.

Introdução

Terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) é o processo de utilizar a enzima TdT para anexar dUTP a 3 'da dupla e ADN de cadeia simples quebra ^12,23. O método TUNEL para detecção de apoptose e DNA dano foi relatada pela primeira vez mais de 20 anos atrás por Gavrieli et al. ^1,12,24. Desde então, foi avaliado e otimizado em diferentes preparações de tecido ^7,23,27,40. TUNEL foi usado para estudar a morte celular induzida por isquemia de neurónios ^6,14,29 e cardiomiócitos ^43,44, morte celular neuronal excitotóxica ^30,31, e como biomarcador no tratamento....

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde ^26. O protocolo (MO13M391) foi aprovado pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins.

1. Neonatal Rato Sacrifício, Dissection, e Fixação

1. Sacrifique um rato neonatal por inalação de _CO2.
2. Cortar imediatamente o hindlimb acima do joelho. Até o dia pós-natal aproximadamente 7, os ossos da perna são suaves o suficiente para cortar com tesoura grande laboratório ou lâmina....

Resultados

Com coloração bem sucedido, sinal TUNEL-positivo deve ser brilhante o suficiente para isolar a partir de autofluorescência definindo limites de intensidade. Objetos TUNEL-positivos em baixa ampliação pode aparecer fragmentos irregulares como brilhantes no músculo esquelético (Figura 1A). No entanto, a maior ampliação, alguns objetos TUNEL-positivo com a morfologia apoptótica clássico deve ser observado, se o tipo de morte celular envolvido é a apoptose (Figura 1B). O controlo positivo (.......

Discussão

Um método para detectar e analisar quantitativamente a apoptose do ADN associada a danos no músculo esquelético de rato está descrito. O procedimento inclui a colheita de tecidos, coloração TUNEL, aquisição de imagem digital e análise de imagens. Fornecimentos histológicos comuns e ferramentas são necessárias, e um kit especial TUNEL comercial é necessária. Os itens de equipamento grandes essenciais necessários são um criostato, microscópio de epifluorescência, com capacidade de imagem digital, e um sistema de computado.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato	Ciências de Microscopia Eletrônica	19202	Para os procedimentos descritos aqui, a solução a 4% foi preparada fresca do pó. Pode ser utilizado paraformaldeído de qualquer fornecedor. A solução de formaldeído preparada deve ser armazenada a 4 & C e não deve ser usado após a data de validade (até vários meses). O paraformaldeído é um carcinógeno e uma toxina por inalação e contato com a pele. Siga as precauções especificadas na MSDS ao manusear o paraformaldeído.
Sacarose	Sigma	S0389	Usado para crioproteção de tecido antes do congelamento. Pode ser utilizada sacarose de qualquer fornecedor.
O.C.T. composto	Tissue-Tek	4583	Meio de inclusão para crioseccionamento.
Criostato	Leica	CM 3050S	Um criostato Leica CM3050S foi usado para as preparações aqui descritas. Qualquer criostato capaz de cortar 10 μ m seções podem ser usadas.
Lâminas de vidro, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Podem ser usadas lâminas de qualquer fornecedor.
Gelatina	Sigma	G-9391	A gelatina é usada para promover a adesão da seção de tecido às lâminas de vidro. Para revestir lâminas de vidro com gelatina, dissolva 2,75 g de gelatina e 0,275 g de alúmen de cromo em 500 ml de água destilada, aqueça a 60 graus; C, mergulhe as lâminas por alguns segundos e deixe secar. Gelatina de qualquer fornecedor pode ser usada. Alternativamente, lâminas pré-revestidas com gelatina podem ser adquiridas.
Sulfato de potássio de cromo (III) dodecahidratado (alúmen de cromo)	Sigma	243361	O alúmen de cromo é adicionado à solução de gelatina para promover a adesão do tecido em lâminas de vidro. É um possível carcinógeno e uma toxina por inalação e contato com a pele. Siga as precauções especificadas na MSDS ao manusear alúmen cromado.
Reagente de adesão tecidual Vectabond	Vector Labs	SP-1800	Substrato opcional para melhor adesão do tecido às lâminas de vidro; em vez disso, podem ser utilizadas lâminas revestidas com gelatina.
Tween20	Sigma	P9416	Um detergente usado para permeabilizar o tecido. Tween20 de qualquer fornecedor pode ser usado.
Triton X100	Sigma	T8787	Um detergente usado para permeabilizar tecidos. Triton X100 de qualquer fornecedor pode ser usado.
Kit de detecção de apoptose TACS 2 TdT fluoresceína in situ	Trevigen	4812-30-K	Kit comercial para rotulagem TUNEL baseada em fluorescência.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(incluído com o kit)
DNase/nuclease tampão	Trevigen	4812-30-K	(incluído com o kit)
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.4	Amresco	780	Faça 1x PBS para lavagens e diluições. PBS de qualquer fornecedor pode ser usado.
Água livre de DNase	Quality Biologicals	351-029-131	Água de qualquer fornecedor pode ser usada.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Corante nuclear. Qualquer corante nuclear fluorescente azul pode ser usado. Como um corante de ligação ao DNA, o Hoechst é suspeito de ser cancerígeno e deve ser manuseado com equipamento de proteção para minimizar o contato com a pele.
Parafilm M	multiple	807	Pode ser utilizada qualquer outra película hidrofóbica ou lamínula. Disponível em vários fornecedores.
Microscópio fluorescente com câmera digital	--	-	Qualquer microscópio fluorescente capaz de capturar digitalmente fluorescência vermelha, verde e azul em canais separados pode ser usado.
Mídia antidesbotamento Vectashield	Vector Labs	H-1000	Mídia antidesbotamento de qualquer fornecedor pode ser usada.
lamínulas de vidro, espessura nº 1	Brain Research Labs	2222-1	Podem ser usadas lamínulas de qualquer fornecedor. O menor tamanho de 22 x 22 mm é suficiente para seções de pernas de camundongos neonatais.
Esmalte	Ted Pella	114-8	Usado para selar lamínulas. Esmaltes de qualquer fornecedor (incluindo varejistas regulares) podem ser usados. Evite usar esmaltes com cores ou aditivos que possam refletir a luz durante a imagem fluorescente.