קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
פיתוח biofilm קנדידה אלביקנס על משטחי יוטיים ו / או א-ביוטי מהווה איום ספציפי לחולים מאושפזים. עד כה, ג biofilms אלביקנס נחקרו בעיקר במבחנה, אך יש צורך חיוני להבנה טובה יותר של התהליך הדינמי הזה, לפי תנאי in vivo. פיתחנו מודל עכברים תת עורי in vivo ללמוד C. היווצרות biofilm אלביקנס. במודל שלנו, מרובה (עד 9) מכשירי -infected קנדידה מושתלים לחלק האחורי של בעלי החיים. זה נותן לנו יתרון גדול על פני מערכת מודל צנתר הוורידים המרכזית כפי שהוא מאפשר לנו ללמוד כמה biofilms העצמאי בבעל חיים אחד. לאחרונה, אנו מותאמים מודל זה ללמוד C. פיתוח biofilm אלביקנס בעכברים / ג BALB. במודל זה, להתבגר ג biofilms אלביקנס לפתח בתוך 48 שעות ולהדגים את ארכיטקטורת biofilm תלת-ממדית הטיפוסית. כימות של פטריית biofilmהוא שלאחר המוות ניתח באופן מסורתי ודורש הקרבה מארח. כי זה דורש שימוש בבעלי חיים רבים לבצע מחקרים הקינטית, אנחנו מוחלים הדמיה פליטת אור לא פולשנית (BLI) לlongitudinally מעקב in vivo בוגר ג אלביקנס biofilms פיתוח במודל תת-עורי שלנו. ג תאי אלביקנס הונדסו לבטא את גן Gaussia לוציפראז פרינקפס (gLuc) הצמוד לקיר התא. אות פליטת אור מופקת על ידי לוציפראז שממיר את coelenterazine המצע הוסיף לאור שניתן למדוד. אות BLI דומה ספירת תאים המתקבלת מצנתרי explanted. הדמיה לא פולשנית לכימות בהיווצרות biofilm vivo מספקת יישומים מיידיים להקרנה והאימות של תרופות נגד פטריות בתנאי in vivo, כמו גם למחקרים המבוססים על אינטראקציות מארח הפתוגן, תורם בזאת להבין טוב יותרing של הפתוגנזה של הזיהומים הקשורים קטטר.
Introduction
קנדידה אלביקנס הוא אורגניזם commensal, אשר ניתן למצוא באתרים של אנשים בריאים שונים, למשל בעור או כחלק ממערכת העיכול והצומח בנרתיק. עם זאת, בבית חולים, ובעיקר immunocompromised חולים, הוא עלול לגרום למגוון רחב של זיהומי 1. אצל אנשים כאלה, המערכת החיסונית המוחלשת מאפשרת לתאי קנדידה להפיץ למחזור הדם ולפלוש לרקמות עמוקות יותר גורמים לזיהומים מסכני חיים. בנוסף, הנוכחות של מצעי א-ביוטי, כמו קטטרים ורידים ושתן מרכזיים, מסתמי לב מלאכותיים ומפרקים עשויות לספק נישה לקנדידה קובץ מצורף 2. הדבקה על מצעים כזה היא תנאי הכרחי לפיתוח biofilm נוסף, המייצג את שכבה של תאי שמרים וhyphal המוטבעים בחומר פולימרים תאי, בעיקר בהיקף של סוכרים 2. ג זיהומי קטטר -associated אלביקנסמשויכים שיעור תמותה גבוה. מאפיין כללי של biofilms הוא הרגישות ירדה אנטי פטרייתי ידועה, כגון azoles 3,4. שיעורים רק חדשים יותר של תרופות נגד פטריות, כגון echinocandins וניסוח liposomal של amphotericin B הוכיחו להיות פעיל נגד הזיהומים הקשורים קטטר 5-7. בגלל עמידות biofilm לאנטי פטרייתי, גישות טיפוליות מוגבלות מאוד, לעתים קרובות מובילות להסרת הקטטר והחלפתה לאחר מכן כפתרון יחיד.
רוב ההבנה הנוכחית שלנו של ג פיתוח biofilm אלביקנס מקורו בניסויים במבחנה על מצעי אביוטי כגון פוליסטירן, או פלסטיק המשמשים לייצור של מכשירים הנ"ל, כלומר, סיליקון, פוליאוריטן 2. מודלים אלה הם די מתקדמים ולנסות לחקות את המצב בvivo ככל האפשר. עם זאת, מערכות אלה אינן כרוכים בזרימת הדם רציפה וtהוא מערכת חיסונית של המארח. זה הביא לפיתוח של מערכות מודל in vivo, כגון מודל צנתר ורידים המרכזי (CVC) 8-10, מודל stomatitis התותבת של פטרת הפה 11 ומודל עכברי לcandiduria הקשורים קטטר 12. בנוסף, ג פיתוח biofilm אלביקנס נחקר in vivo על המשטחים הריריים, כמו אלה מחלל נרתיק 13 ושבעל-פה 14. המעבדה שלנו תרמה להקמתה של ג תת עורית מודל אלביקנס biofilm, המבוסס על השתל של חתיכות קטטר נגועות בחלק האחורי של חולדות ספראג Dawley 15. מודל זה שימש בהצלחה במעבדה שלנו כדי לבדוק את רגישות biofilm לfluconazole וechinocandin תרופות 5,16, כדי לחקור את ההשפעה של טיפול קומבינטורית של diclofenac וקספופונגין 17. לאחרונה, אנו מותאמים מערכת זו לשימוש בעכברים / ג BALB 18,19. בהשוואה עם אחרים במודלי vivo, היתרון העיקרי של מודל זה הוא תת-עורי את האפשרות ללמוד biofilms מרובה לכל בעלי חיים שפותחו בתוך לומן של חתיכות צנתר מושתלות.
כדי לצמצם את מספרם של בעלי החיים במעבדה, יש לנו להתאים את המודל הזה כדי ללמוד את הפיתוח של ג אלביקנס biofilms הלא פולשני באמצעות הדמיה פליטת אור (BLI) 18,19. שיטה זו הוכיחה את עצמו טכניקה רבת עוצמה, אשר ניתן להשתמש בי לכמת biofilms ידי מדידת האות הספציפית BLI באזור של עניין (במקרה שלנו על השטח של צנתרים מושתלים), הימנעות הקרבת בעלי חיים. בהשוואה לחיידקים, שיכול לבטא את שני הגנים ואת המצע הדרוש לתגובת פליטת אור עקב כניסתה של אופרון לוקס ספציפי 20, רוב האורגניזמים אוקריוטים, כולל C. אלביקנס, תלוי בביטוי Heterologous של גן בלוציפראז בשילוב עםממשל חיצוני של מצע ספציפי, כגון D-luciferin או coelenterazine 21. כנראה בשל נוכחותם של דופן התא פטרייתי וג המורפוגנזה אלביקנס, המשלוח תאיים של המצע לאנזים בלוציפראז היה אתגר עיקרי 21. על מנת לפתור בעיה זו, Enjalbert et al. 22 מהונדס מתח שבו ג סינטטי הגרסה מותאמת לקודון אלביקנס של הגן ללוציפראז פרינקפס Gaussia מופרש באופן טבעי (gLuc) הייתה התמזג לג גן אלביקנס PGA59, GPI- מעוגן דופן תא חלבון. בגלל הנוכחות של לוציפראז בקיר התא, ניתן למנוע בעיות הנוגעות לזמינות תאית של המצע. מערכת מסוימת זו שימשה ללמוד זיהומים שטחיים שנגרמו על ידי ג 22 אלביקנס. ממש לאחרונה, BLI היה בשימוש גם כדי לעקוב אחר ההתקדמות של פטרת לוע התחתון וpossiblטיפול בדואר 23. ממצאים אלה תומכים בשימוש בBLI כטכניקה מבטיחה ללמוד זיהומים הנגרמים על ידי תאי חיים נטולי אלא גם זיהומים הקשורים מכשיר.
במחקר זה, אנו מתארים את C. פיתוח biofilm אלביקנס על פיסות קטטר פוליאוריטן בעכברי BALB / c והכימות שלה באמצעות BLI. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של קולוניזציה במבחנה של צנתרים פוליאוריטן בתקופת ההידבקות אחרי השתלה בעכברים ובפיתוח biofilm שלאחר מכן בבעלי חיים. מלבד מדידת אות BLI הנפלטת על ידי ג תאי אלביקנס, אנחנו גם לקבוע את המושבה להרכיב יחידות להשוואה עם הטכניקה סטנדרטית לכימות עומס פטרייתי biofilm.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש במודלים של בעלי חיים, ומודלים של מכרסמים במיוחד, ללימודים המוקדשים לbiofilms חיידקים הוא מאוד חשוב כמו המערכת החיסונית המארח הוא גורם חיוני בהיווצרות biofilm שמודלים במבחנה לא יכולים להסביר. במחקר זה, אנו מתארים ג תת-עורי פשוט יחסית מודל אלביקנס עכבר bio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
Referências
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
