Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
Biyotik ve / veya abiyotik yüzeylerde Candida albicans biyofilm gelişimi yatan hastalar için özel bir tehdit oluşturmaktadır. Şimdiye kadar, C albicans biyofilm in vitro ağırlıklı incelenmiştir, ancak, in vivo koşullar altında bu dinamik işlemin daha iyi anlaşılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Biz C çalışma bir in vivo deri altı sıçan modeli geliştirdi albicans biyofilm oluşumu. Bizim modelde, (9'a kadar) birden Candida enfekte olan cihazlar hayvanın arka kısmına implante edilir. Bize bir hayvanda birçok bağımsız biyofilm çalışma sağlar gibi bu santral venöz kateter modeli sistemi üzerinden bize büyük bir avantaj sağlıyor. Son zamanlarda, biz C incelemek için bu modeli adapte BALB / c farelerine albicans biyofilm gelişimi. Bu modelde, C olgun albicans biyofilm 48 saat içinde geliştirmek ve tipik üç-boyutlu biyofilm mimarisi göstermektedir. mantar biyofilm ölçümügeleneksel analiz otopsi ve ev sahibi fedakarlık gerektirir. Bu kinetik çalışmalar yapmak birçok hayvan kullanımını gerektirdiğinden, biz uzunlamasına olgun in vivo takip C'ye non-invaziv biyoluminesans görüntüleme (BLI) uygulanan albicans, bizim deri altı modeli gelişmekte biyofilm. C albicans hücreleri hücre duvarına bağlı Gaussia princeps lusiferaz geni (glukozit) ifade etmek için tasarlanmış edildi. biyoışıldama sinyali ölçülebilir ışık ilave edilmiş substrat koelenterazin dönüştürür lusiferaz tarafından üretilir. BLI sinyal Eksplante kateter elde edilen hücre sayımları benziyordu. In vivo biyofilm oluşumu ölçülmesi için Non-invaziv görüntüleme daha iyi anlamak için, burada katkı yanı sıra konak-patojen etkileşimleri dayalı çalışmalar için in vivo koşullarda tarama ve antifungal ilaçların doğrulama için acil uygulamalar sağlarKateter ilişkili enfeksiyonların patogenezi ing.
Introduction
Candida albicans, deri üzerinde ya da gastrointestinal ve vajinal florasının bir parçası olarak, örneğin, sağlıklı bireylerin farklı yerlerde bulunan bir ortakçı bir organizmadır. Bununla birlikte, içinde yatan ve özellikle immünokompromize hastalar, bu enfeksiyonların 1 geniş bir neden olabilir. Bu tür kişilerde, bağışıklık sisteminin zayıflamasına Candida hücreleri kan dolaşımına yaymak ve yaşamı tehdit eden enfeksiyonlara neden olan derin dokuları istila sağlar. Buna ek olarak, örneğin merkezi venöz ve idrar sondaları gibi abiyotik alt-tabakaların mevcudiyeti, suni kalp kapakçıkları ve eklemler, Candida ek 2 için bir niş sağlayabilir. Bu tür substratlara yapışma esas polisakaritlerin 2 oluşan hücre dışı bir polimerik malzeme içinde gömülü maya ve hifal hücre katmanı temsil daha biyofilm gelişimi için bir ön koşuldur. C albicans kateter enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde enfeksiyonlaryüksek mortalite ile ilişkilidir. Biyofilm genel karakteristiği gibi azollerin 3,4 olarak bilinen antifungal, onların azalmış duyarlılık olduğunu. Bu tür ekinokandinler ve amfoterisin B lipozom formülasyonu olarak antifungal ilaçların yalnızca yeni sınıflar, kateter ilişkili enfeksiyonların 5-7 karşı aktif olduğunu kanıtladı. Için anti-fungal maddeler ile biyofilm esneklik terapötik yaklaşımlar çok sık kateter çıkarılması ve tek çözüm olarak daha sonraki değiştirilmesine yol açacak şekilde sınırlıdır.
C bizim mevcut anlayış çoğu albicans biyofilm geliştirme, yukarıda belirtilen aygıtlar, örneğin, silikon, poliüretan, 2 imalatında kullanılan abiyotik polistiren gibi substratları ya da plastik üzerinde in vitro çalışmalar kaynaklanır. Bu modeller oldukça gelişmiş ve mümkün olduğunca yakından in vivo durumu taklit deneyin. Bununla birlikte, bu sistemler, sürekli bir kan akışı ve t içermeyenO konağın bağışıklık sistemi. Bu tür santral venöz kateter (SVK) modeli 8-10, oral kandidiyazis 11 protez stomatit modeli ve kateter ilişkili kandidüri 12 için bir fare modelinde olarak in vivo model sistemlerinde, geliştirme sonuçlandı. Buna ek olarak, C albicans biyofilm gelişimi vajina 13 ve ağız 14 gibi mukozal yüzeyler üzerinde in vivo incelenmiştir. Laboratuvarımız deri altı C kurulması ile katkıda Sprague Dawley sıçanların 15 arkasındaki enfekte kateter adet implant dayanmaktadır albicans biyofilm modeli. Bu model başarılı diklofenak ve Kaspofungin 17 kombinasyon tedavisinin etkisini incelemek için, uyuşturucu 5,16 Flukonazole biyofilm duyarlılığı test etmek ve ekinokandin bizim laboratuvarda kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, BALB / c farelerinde 18,19 kullanmak için bu uyum sağlamıştır. Içindein vivo modellerde diğer ile karşılaştırılması, bu deri altı modelin ana avantajı implante kateter adet lümen içinde geliştirilen hayvan başına birden fazla biyofilm çalışma imkanı vardır.
Deney hayvanlarının sayısını azaltmak için, biz C gelişimini incelemek için bu modeli adapte olması albicans biyoışıldama görüntüleme (BLI) 18,19 kullanılarak non-invaziv biyofilm. Bu yöntem, hayvan kurban kaçınarak, (bu durumda implant kateterlerin bölge) ilgi bölgesi spesifik BLI bir işaret ölçülerek biyofilm ölçmek için kullanılabilecek etkili bir teknik olduğunu kanıtladı. C de dahil olmak üzere bağlı bir özel lux operon'u 20 giriş geni ve biyoışıldama reaksiyon için gerekli olan alt-tabakanın her iki ifade bakterilerin göre, içinde, en ökaryotik organizmalar, albicans, ile birlikte bir lusiferaz geninin heterolog ekspresyonu bağlıdırD-luciferase veya koelenterazin 21 gibi belirli bir substrat, dış yönetim. Muhtemelen, fungal hücre duvarı ve C varlığına albicans morfonogenezi, lusiferaz enzim için substrat hücre içi teslimat ana zorluk 21 oldu. Bu sorunu çözmek için, Enjalbert ve ark. 22, bir yük tasarlanmış burada sentetik C doğal salgılanan Gaussia princeps lusiferaz için bir gen (glukozit) albicans kodon-optimize edilmiş türden C ile kaynaştırılır albicans PGA59 geni, bir GPI- hücre duvarı protein demirli. Çünkü hücre duvarındaki lusiferaz varlığı, substrat hücre içi temin edilebilirliğine ilişkin sorunlar önlenebilir. Bu özel sistem C'nin neden olduğu yüzeysel enfeksiyonları incelemek için kullanılan albicans 22. Çok yakın, BLI da orofaringeal kandidiyazis ve possibl ilerlemesini izlemek için kullanılmıştıre tedavisi 23. Bu bulgular serbest yaşayan hücreler aynı zamanda cihazın ilişkili enfeksiyonların yol açtığı enfeksiyonları incelemek için umut verici bir yöntem olarak BLI kullanımını desteklemektedir.
Bu çalışmada, C tarif BL kullanılan poliüretan kateter, BALB / c farelerinde parçaları ve nicelenmesine albicans biyofilm gelişimi. Biz canlı hayvan farelerde implantasyon ve sonraki biyofilm gelişimi takip yapışma döneminde poliüretan kateter in vitro kolonizasyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Apart C. tarafından yayılan BLI sinyalini ölçerek gelen albicans hücreleri, biz de biyofilm mantar yük ölçümü için standart tekniği ile karşılaştırma için birimleri oluşturan koloni belirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
konak bağışıklık sistemi in vitro modeller için hesap edemez biyofilm oluşumunda önemli bir faktör olarak mikrobiyal biyofilm adanmış çalışmalar için hayvan modellerinde, özellikle kemirgen modellerin kullanılması çok önemlidir. Bu çalışmada, oldukça basit bir deri altı C tarif Kolayca bir araştırma laboratuvarında kabul edilebilir ve güçlü teknik beceri gerektirmez albicans biyofilm fare modeli. Bu model, ilk olarak bir sıçanın 24 epidermidis</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
Referências
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
