생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 개발
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
생물 및 / 또는 비 생물 적 표면에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 생물막 개발은 입원 환자에 대한 특정 위협을 나타냅니다. 지금까지, C. 알비 칸스 생물막은 시험관 내에서 주로 연구되어 있지만 생체 내 조건에서 이러한 역동적 인 과정의 더 나은 이해를위한 중요한 필요성이있다. 우리는 C.을 연구 생체 내 쥐 피하 모델을 개발 알비 칸스의 biofilm 형성. 우리의 모델에서, (9 개) 칸디다 -infected 여러 장치 동물의 후방 부에 주입된다. 그것은 우리가 하나의 동물에서 여러 독립적 인 생물막 (biofilm)을 연구 할 수 있도록 이것은 중심 정맥 카테터 모델 시스템을 통해 우리에게 중요한 이점을 제공합니다. 최근에, 우리는 C.을 연구하는이 모델을 적용 BALB / c 마우스에서 알비 칸스의 바이오 필름 개발. 이 모델에서 성숙 C. 알비 칸스의 바이오 필름은 48 시간 내에 개발하고 전형적인 세 가지 차원 생물막 구조를 보여줍니다. 곰팡이 바이오 필름의 정량화전통적으로 분석 사후이며 호스트 희생이 필요합니다. 이 연구는 운동을 수행하기 위해 많은 동물의 사용을 필요로하기 때문에, 우리는 길이 방향으로 성숙 생체 후속 C. 비 침습적 생물 발광 영상 (BLI)을인가 알비 칸스 (Candida albicans)는 우리의 피하 모델 개발 생물막. C.를 알비 칸스 세포는 세포벽에 부착 Gaussia 프린셉 루시페라아제 유전자 (gLuc)을 발현하도록 유전자 조작 하였다. 생물 발광 신호를 측정 할 수있는 광으로 첨가 기질 코 엘렌 테라 진 변환 루시퍼 라제에 의해 생성된다. BLI 신호는 외식 카테터에서 얻은 세포 수를 닮았다. 생체 biofilm 형성에 정량화를위한 비 침습적 영상은 더 잘 이해로, 이에 기여뿐만 아니라 호스트 병원체 상호 작용을 기반으로 연구를위한 생체 조건에서 검사 및 항진균 약물의 유효성 검사를위한 즉각적인 응용 프로그램을 제공합니다카테터 관련 감염의 병인으로 보내고.
Introduction
칸디다 알비 칸이나 피부 및 위장관 질 식물의 일부로서, 예를 들어, 정상인의 다른 부위에서 발견 될 수 공생 유기체이다. 그러나, 입원, 특히 면역 저하 환자, 그 감염 한 다양한 발생할 수있다. 이러한 개인으로, 면역 체계 약화은 칸디다 세포가 혈류로 배포하고 생명을 위협하는 감염을 일으키는 깊은 조직을 침범 할 수 있습니다. 게다가, 중심 정맥 카테터 ㆍ 뇨와 같은 비 생물학적 기재의 존재는, 인공 심장 판막과 관절 칸디다 첨부 2 틈새를 제공 할 수있다. 이러한 기판 밀착성이 주로 다당류로 이루어진 세포 외 폴리머 물질에 매립 효모 및 균사 세포 층을 나타내고 상기 생물막 개발을위한 필수 조건이다. C. 알비 칸스 (Candida albicans) 카테터 -associated 감염높은 사망률과 연관되어 있습니다. 생물막의 일반적인 특성은 공지 된 3,4- 아졸 항진균제, 그들의 감수성 감소이다. 이러한 echinocandins 및 암포 테리 신 B의 리포좀 제형으로 항진균제 만 새로운 클래스는, 카테터 관련 감염 5-7에 대한 활성 것으로 판명. 때문에 항진균제에 생물막 탄력성의 치료 방법은 매우 자주 카테터 제거 및 단독 솔루션으로 그 이후의 교체로 이어지는 제한됩니다.
C. 우리의 현재 이해의 대부분 알비 칸스 생물막 개발은 전술 한 장치, 즉, 실리콘, 폴리 우레탄 (2)의 제조에 사용되는 비 생물 성 폴리스티렌과 같은 기판, 또는 플라스틱에 대한 시험 관내 연구에서 유래. 이러한 모델은 상당히 진보와 가능한 한 근접 생체 내 상황을 모방하려고. 그러나, 이러한 시스템들은 연속 혈류 및 t를 포함하지 않는다그는 호스트의 면역 시스템. 이것은 중심 정맥 카테터 (CVC) 모델 8-10, 구강 칸디다증 (11)의 의치 구내염 모델과 카테터 관련 칸디다 12 생쥐 모델로 생체 내 모델 시스템의 개발 결과. 또한, C. 알비 칸스의 바이오 필름 개발은 질 (13)과 구강 (14)의 것과 점막 표면에 생체 내에서 연구되었다. 우리 연구실은 피하 C.의 설립에 기여 스프 라그 돌리 래트 (15)의 뒷면에 감염된 카테터 조각 임플란트에 기초 칸스 생물막 모델. 이 모델은 성공적으로 디클로페낙과 caspofungin (17)의 조합 치료의 효과를 연구하기 위해, 약 5,16를 플루코나졸에 바이오 필름 감수성을 테스트하고 echinocandin 우리 실험실에서 사용되었다. 더 최근에는 BALB / c 마우스 (18, 19)에 사용하기 위해 본 시스템 장치. 에생체 내에서 다른 모델과의 비교는,이 피하 모델의 주요 이점은 카테터 주입 편 루멘 내부 개발 동물 당 여러 생물막을 연구 할 수있는 가능성이다.
실험 동물의 수를 줄이기 위해, 우리는 C.의 개발을 연구하는이 모델을 적응 알비 칸 생물 발광 영상 (BLI) 18, 19을 이용하여 비 침습적으로 생물막. 이 방법은 동물의 희생을 피 (우리의 경우 카테터의 주입 영역) 관심 영역에서 특정 BLI 신호를 측정함으로써 바이오 필름을 정량화하는데 사용될 수있는 강력한 방법 인 것으로 판명되었다. C. 포함 인해 특정 LUX 오페론 (20)의 도입 유전자 및 생물 발광 반응에 필요한 양 기판을 표현할 수 박테리아 비교에서, 대부분의 진핵 생물 알비 칸, 결합 루시퍼 라제 유전자의 이종 발현에 의존이러한 D-루시페린 또는 코 엘렌 테라 진 (21)과 같은 특정 기판의 외부 투여. 아마도 진균 세포벽 및 C.의 존재 알비 칸스 형태 형성, 루시퍼 라제 효소 기질의 세포 내 전달이 주된 과제 21이었다. 이 문제를 해결하기 위해, Enjalbert 등. 22 균주를 설계 여기서 합성 C. 자연적으로 분비 Gaussia의 프린셉 루시 페라 제 유전자 (gLuc)의 알비 칸스 코돈 최적화 된 버전은 C.에 융합되었다 알비 칸스 PGA59 유전자는 GPI-는 세포벽 단백질을 고정. 때문에 칸막이 벽에서 루시퍼 라제의 존재, 기재의 세포 여부에 관한 문제를 회피 할 수있다. 이 특별한 시스템은 C.에 의한 표재성 감염을 연구하는 데 사용되었다 알비 칸스 (22). 최근에, 또한 BLI 구인두 칸디다증 및 possibl의 진행을 수행하기 위해 사용되었다전자 처리 (23). 이러한 연구 결과는 자유 살아있는 세포뿐만 아니라 장치 관련 감염에 의한 감염을 연구하는 유망 기술로 BLI의 사용을 지원합니다.
이 연구에서 우리는 C.을 설명 BLI를 사용하여 폴리 우레탄 카테터 BALB / c 마우스의 조각과 정량에 알비 칸스의 바이오 필름 개발. 우리는 살아있는 동물의 생쥐에 주입 및 후속 생물막 개발 뒤에 부착 기간 동안 폴리 우레탄 카테터의 시험 관내 콜로니의 상세한 프로토콜을 제공한다. 그렇다 C. 의해 방출 BLI 신호를 측정으로부터 알비 칸스 세포, 우리는 또한 생물막 곰팡이로드 정량 표준 기술과의 비교를 위해 단위를 형성 식민지를 결정합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
숙주 면역 시스템은 시험 관내 모델을 설명 할 수 없다 생물막 형성에 필수 요소이기 때문에 미생물의 생물막 전용 연구 동물 모델, 특히 설치류 모델의 사용이 매우 중요하다. 본 연구에서는 비교적 간단한 설명을 피하 C. 쉽게 연구 실험실에서 채택 될 수 있으며, 강력한 기술적 인 능력을 필요로하지 않습니다 알비 칸스 생물막 마우스 모델. 이 모델은 원래 쥐의 표…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
Referências
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