Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
Candida albicans desarrollo de biopelículas en superficies bióticos y / o abióticos representa una amenaza específica para los pacientes hospitalizados. Hasta ahora, C. biofilms albicans se han estudiado principalmente in vitro, pero hay una necesidad crucial para una mejor comprensión de este proceso dinámico pt condiciones in vivo. Hemos desarrollado un modelo de rata subcutánea en vivo para estudiar C. la formación de biopelículas albicans. En nuestro modelo, múltiple (hasta 9) dispositivos infectados por Candida se implantan a la parte trasera del animal. Esto nos da una gran ventaja sobre el modelo de sistema de catéter venoso central, ya que nos permite estudiar varios biofilms independientes en un solo animal. Recientemente, hemos adaptado este modelo para estudiar C. el desarrollo del biofilm albicans en ratones Balb / c. En este modelo, madurar C. biofilms albicans se desarrollan dentro de 48 horas y demuestran la arquitectura de las biopelículas tridimensional típico. La cuantificación de biofilm fúngicaes tradicionalmente analizada post mortem y requiere sacrificio anfitrión. Debido a que este requiere el uso de muchos animales para llevar a cabo estudios cinéticos, se aplicó imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) longitudinalmente seguimiento in vivo madurar C. albicans biofilms desarrollar en nuestro modelo subcutánea. C. albicans células fueron diseñados para expresar el gen de la luciferasa Gaussia princeps (gluc) unido a la pared celular. La señal de bioluminiscencia es producido por la luciferasa que convierte la coelenterazina sustrato añadido a la luz que se puede medir. La señal de BLI parecía recuentos de células obtenidas de catéteres explantadas. Imagen no invasivas para la cuantificación de la formación de biopelículas vivo ofrece aplicaciones inmediatas para la selección y validación de fármacos antifúngicos pt condiciones in vivo, así como para los estudios basados en las interacciones huésped-patógeno, por este medio que contribuye a un mejor entenderción de la patogénesis de las infecciones asociadas al catéter.
Introduction
Candida albicans es un organismo comensal, que se puede encontrar en diferentes sitios de individuos sanos, por ejemplo sobre la piel o como una parte de la flora gastrointestinal y vaginales. Sin embargo, en hospitalizados, y sobre todo pacientes inmunodeprimidos, puede causar una amplia gama de infecciones 1. En estos individuos, el sistema inmunológico debilitado permite que las células de Candida para difundir en el torrente sanguíneo y que invaden los tejidos más profundos que causan las infecciones que amenazan la vida. Además, la presencia de sustratos abióticos tales como catéteres venosos centrales y urinarios, válvulas cardíacas artificiales y las articulaciones puede proporcionar un nicho para Candida fijación 2. La adhesión a tales sustratos es un requisito previo para el desarrollo de biopelículas, que representa una capa de células de levadura y de hifas embebidos en el material polimérico extracelular, que consiste principalmente de polisacáridos 2. C. infecciones por catéter -asociado albicansestán asociados con una alta tasa de mortalidad. Una característica general de las biopelículas es su disminución de la susceptibilidad a los antifúngicos conocidos, tales como azoles 3,4. Sólo nuevas clases de fármacos antifúngicos, tales como las equinocandinas y la formulación liposomal de anfotericina B demostraron ser activos contra las infecciones asociadas al catéter 5-7. Debido a la resistencia a los antifúngicos biofilm, los enfoques terapéuticos son muy limitados, a menudo conduce a la retirada de la sonda y su posterior reemplazo como solución única.
La mayor parte de nuestra comprensión actual de C. desarrollo de la biopelícula albicans origina a partir de los estudios in vitro sobre sustratos abióticos tales como poliestireno o plásticos utilizados para la fabricación de los dispositivos anteriormente mencionados, es decir, silicona, poliuretano 2. Estos modelos son bastante avanzada y tratar de imitar la situación in vivo tan estrechamente como sea posible. Sin embargo, estos sistemas no implican el flujo de sangre continuo y tque el sistema inmune del huésped. Esto resultó en el desarrollo de sistemas de modelos in vivo, tales como el modelo de catéter venoso central (CVC) 8-10, el modelo estomatitis protésica de la candidiasis oral 11 y un modelo murino para asociada al catéter candiduria 12. Adicionalmente, C. desarrollo de la biopelícula albicans se estudió in vivo en las superficies de las mucosas, tales como las de la vagina 13 y la cavidad oral 14. Nuestro laboratorio contribuyó con la creación de un C. subcutánea modelo de biofilm albicans, que se basa en el implante de piezas catéter infectado en la parte posterior de las ratas Sprague Dawley 15. Este modelo fue utilizado con éxito en nuestro laboratorio para probar la susceptibilidad biofilm al fluconazol y equinocandina drogas 5,16, para estudiar el efecto de la terapia combinatoria de diclofenaco y caspofungina 17. Más recientemente, se adaptó este sistema para su uso en ratones BALB / c 18,19. Encomparación con otros modelos in vivo, la principal ventaja de este modelo subcutánea es la posibilidad de estudiar múltiples biofilms por animal desarrollado en el interior del lumen de piezas catéter implantado.
Para reducir el número de animales de laboratorio, hemos adaptado este modelo para estudiar el desarrollo de C. albicans biofilms no invasiva mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) 18,19. Este método ha demostrado ser una técnica poderosa, que puede ser utilizado para cuantificar las biopelículas mediante la medición de la señal específica BLI en la región de interés (en nuestro caso, el área de catéteres implantados), evitando el sacrificio de animales. En comparación con las bacterias, que puede expresar tanto el gen y el sustrato necesario para la reacción de bioluminiscencia debido a la introducción de un operón lux específica 20, la mayoría de los organismos eucariotas, incluyendo C. albicans, son dependientes de la expresión heteróloga de un gen de la luciferasa, junto con eladministración externa de un sustrato específico, tal como D-luciferina o coelenterazina 21. Probablemente debido a la presencia de la pared celular fúngica y C. morfogénesis albicans, el suministro intracelular del sustrato para la enzima luciferasa fue un reto principal 21. A fin de resolver este problema, Enjalbert et al. 22 diseñado una cepa donde un C. sintética albicans versión codón optimizado del gen para la secretada de forma natural Gaussia princeps luciferasa (gluc) se fusionó a la C. gen albicans PGA59, un GPI- anclado proteínas de la pared celular. Debido a la presencia de la luciferasa en la pared celular, los problemas relativos a la disponibilidad intracelular del sustrato podrían evitarse. Este sistema fue utilizado en particular para estudiar infecciones superficiales causadas por C. 22 albicans. Muy recientemente, BLI también fue utilizado para seguir la progresión de la candidiasis orofaríngea y su possible tratamiento 23. Estos hallazgos apoyan el uso de BLI como una técnica prometedora para estudiar infecciones causadas por las células de vida libre, sino también las infecciones asociadas a dispositivos.
En este estudio, se describe la C. el desarrollo del biofilm albicans en piezas de catéter de poliuretano en ratones Balb / C y su cuantificación mediante BLI. Proporcionamos un protocolo detallado de la colonización in vitro de los catéteres de poliuretano durante el período de adherencia seguida de la implantación en ratones y el desarrollo de biopelículas posterior de animales vivos. Además de la medición de la señal emitida por el BLI C. albicans células, que también determinan el unidades formadoras de colonias para la comparación con la técnica estándar para la carga fúngica biofilm cuantificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de modelos animales, y especialmente los modelos de roedores, los estudios dedicados a las biopelículas microbianas es muy importante ya que el sistema inmune del huésped es un factor esencial en la formación de biopelículas que los modelos in vitro no pueden explicar. En este estudio, se describe un relativamente sencillo subcutánea C. albicans biofilm modelo de ratón, que puede ser fácilmente adoptada en un laboratorio de investigación y no requiere fuertes habilidades técnicas. Este …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
Referências
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