Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
Die Untersuchung von Protein-Interaktionen in Zusammenhang mit lebenden Zellen können wichtige Informationen über die Lokalisierung, Dynamik und Interaktionspartner zu erzeugen. Diese Informationen sind im Rahmen der Wirt-Pathogen-Interaktionen besonders wertvoll. Viele Erregerproteine Funktion innerhalb von Wirtszellen in einer Vielzahl von Art und Weise, wie ermöglichen Umgehung des Immunsystems des Wirts und das Überleben in der intrazellulären Umgebung. Um diese Pathogen-Protein-Host-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen, werden verschiedene Ansätze häufig verwendet, unter anderem: in vivo-Infektion mit einem Stamm ein markiertes oder mutierte Protein, oder Einführung von Pathogen-Gene mittels Transfektion oder Transduktion exprimieren. Jeder dieser Ansätze hat Vorteile und Nachteile. Wir suchten ein Mittel, um exogene Proteine direkt in die Zellen einzuführen. Die Elektroporation wird üblicherweise verwendet, um Nukleinsäuren in Zellen einzuführen, wurde jedoch seltener auf Proteine angewandt, obwohl die biophysikalischen Basis ist genau die gleiche.Ein Standard Elektroporator wurde verwendet, um affinitätsmarkierten bakterielle Effektoren in Säugetierzellen einzuführen. Humanen epithelialen und Maus-Makrophagen-Zellen wurden durch traditionelle Methoden kultiviert, freistehend, und in 0,4 cm Abstand Elektroporationsküvetten mit einem exogenen bakteriellen Erreger Protein von Interesse (zB Salmonella Typhimurium GtgE) platziert. Nach der Elektroporation (0,3 kV) und einem kurzen (4 h) Erholungsperiode wurde die intrazelluläre Protein durch Fluoreszenzmarkierung, die das Protein über seine Affinitätsmarkierung und, die räumliche und zeitliche Verteilung von konfokaler Mikroskopie verifiziert. Die elektroporierten Protein wurde auch gezeigt funktionellen innerhalb der Zelle und in der Lage, korrekte subzelluläre Handel und Protein-Protein-Wechselwirkung zu sein. Während die exogenen Proteine eher auf der Oberfläche der Zellen zu akkumulieren, war die elektroporierten Proben große Erhöhungen der intrazellulären Effektors Konzentration bezogen auf allein Inkubation. Das Protokoll ist einfach und schnell genug, um in ap geschehenarallel Mode, so dass für Hochdurchsatz-Charakterisierung der Erreger Proteine in Wirtszellen einschließlich subzelluläre Targeting und Funktion Virulenzproteine.
Introduction
Viele Gram-negative Bakterien zu verwenden spezialisierte Sekretionssysteme zur Virulenz-verwandte Proteine (die als Effektoren bezeichnet) direkt in die Wirtszellen 1-5 injizieren. Diese Effektoren haben eine breite Palette von biologischen Funktionen, einschließlich: Unterdrückung der Wirtsimmunität, Zytoskelett-Änderungen, Änderung der intrazellulären Transport und Signalisierung, Transkriptionsänderungen und Gastgeber Proteasom Änderungen 9.6. Die Funktionen einiger Effektoren sind bekannt, aber die Wirts Ziele und biochemische Wirkung (en) von vielen anderen noch bestimmt werden. Beim Vergleich Wildtyp und rekombinante bakterielle Infektionen ist ein gültiger Ansatz für die intrazelluläre Effektor Virulenzmechanismen studieren, ist es oft von Vorteil, ein individuelles Effektor in die Wirtszelle einzuführen. Somit ist eine einfache Verfahren zum Einbringen und zur Charakterisierung bakterieller Effektor-Proteine im Rahmen von Wirtszellen sehr wünschenswert.
Die Vereinfachung des experimentellen Analyse with eine einzige Effektor ist kritisch, da andere Effektoren können gegnerische oder redundante Funktionen haben. Um diese Vereinfachung zu erreichen, haben die Forscher bereits vorgestellten Makromolekülen in Zellen durch viele verschiedene Methoden, einschließlich der Virusübertragung 10, die Mikroinjektion 11, kratzen Laden 12,13, Zellfusion mit chemisch induzierten Mikroinjektion 14, proprietären Protein "Transfektion" Reagenzien 15, Calciumphosphat Niederschläge 16, 17-20 und Elektroporation. Die eingeführten Moleküle reichen von Nukleinsäuren, einschließlich DNA, RNA, & RNAi-Spezies auf Proteine, zellundurchlässigen Farbstoffen und Antikörpern für die intrazelluläre Targets 21,22. Einige Methoden haben ihre Grenzen, einschließlich der Art von Makromolekülen, die eingeführt werden können, und insbesondere Downstream-Analysen können durch hohe Zelltoxizität, schädlichen Wirkungsmechanismen, geringe Wirksamkeit oder Einführung Effizienz beschränkt. Transfektion, eine often-Methode zur Expression bakterieller Gene in Säugerzellen, leidet auch die Einschränkung, dass einige wichtige Wirtszelltypen, wie beispielsweise Makrophagen und primäre Zellen, sind besonders resistent gegenüber der Transfektion. Darüber hinaus ist es schwierig, das Niveau der Bakterienprotein bei Einführung von Fremd-DNA hergestellt steuern.
Viel Arbeit wurde die Elektroporation von Nukleinsäuren in beiden bakteriellen und Säugerzellen als gemeinsame Labortechnik etablierten; jedoch gibt es ständige Suche nach der besten Methoden für die Bereitstellung Proteine in Zellen unter physiologischen Bedingungen. Berichte über Protein Transfektion sind vielversprechend, aber teure Reagenzien und Optimierung. Der Wunsch, die potentiell toxischen Bakterien Effektoren in eine Vielzahl von Zell Ziele mit minimalen Kosten einführen führte uns zur Elektroporation als Mittel zur Untersuchung dieser Proteine in vivo zu prüfen.
Protein Elektroporation 23-25 ist ein eingehaltenhod, Proteine in lebenden Zellen über Elektropermeabilisierung, auch als elektro-Transfektion oder elektro-Injektion 26 bekannt vor. Diese Technik verwendet hoher Intensität elektrischer Impulse an Poren in den Zellmembranen zu erstellen. Diese reversible Poren ermöglichen Makromoleküle, die normalerweise von intrazellulären Raum ausgeschlossen sind die Zelle zu gelangen. Nach dem Entfernen des äußeren elektrischen Feldes kann die Membran verschließen, so dass die Zelle auf Moleküle, die durch die Poren 27,28 geführt zu halten.
Ein Standard-Elektroporator in dieser Studie verwendet, um bakterielle Effektoren in beiden Maus Makrophagen-ähnlichen Zellen und humane Epithelzellen konsequent einzuführen. Das Verfahren ist schnell, effizient und kostengünstig ist, ohne nennenswerte Verringerung der zellulären Lebensfähigkeit. Die eingebrachten Proteine durch Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar oder für funktionelle Assays verwendet werden. Dies wurde unter Verwendung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als einen nicht-toxischen Standard gezeigt, sowiezwei Salmonella-Effektor-Proteine, SspH1 und GtgE. Wir schlagen Protein Elektroporation als zusätzliches Werkzeug in der Literatur für die Untersuchung der bakteriellen Virulenz-Proteine und ihre Funktionen in eukaryotischen Wirtszellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sezerniert Effektoren aus pathogenen Bakterien entwickelt haben, um innerhalb des Wirtszellenumgebung funktionieren und somit ist es hilfreich, sie in situ in dem Wirt zu detektieren. Einführung spezifischer Effektoren von Interesse in die Wirtszellen können die relevanten Pathogen-Wirt-Wechselwirkungen, in Isolation, ohne Störung von anderen bakteriellen Proteinen untersucht werden. Das Ziel war es, die Elektroporation als Mittel zur bakteriellen Effektorproteine in eukaryotische Wirtszellen einzubrin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
Referências
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino … [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan … [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
