Обтекаемой подход к скрининга для экспрессии рекомбинантных мембранных белков в кишечной палочки на основе слияния с зеленого флуоресцентного белка представлена.
Получение рекомбинантных мембранных белков для структурных и функциональных исследований остается технически сложным из-за низких уровней экспрессии и присущего нестабильность многих мембранных белков раз растворимым в моющих средствах. Данный протокол описывается, что сочетает в себе перевязки независимое клонирование мембранных белков, GFP слияния с выражением в кишечной палочки, обнаруженных флуоресценции GFP. Это позволяет строительство и выражение показ многократного мембранного белка / варианты по определению кандидатов, подходящих для дальнейшего инвестирования времени и усилий. GFP репортер используют в первичном скрининге экспрессии путем визуализации флуоресценции GFP после электрофореза в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE). Мембранные белки, которые показывают как высокий уровень экспрессии с минимальной деградацией, как показано отсутствие свободного GFP, выбирают для вторичного экрана. Эти конструкции масштабировать и общая доля мембрану, приготовленную, и солюбилизациид в четырех различных моющих средств. После ультрацентрифугирования, чтобы удалить нерастворимый моющий материал, лизаты анализировали с помощью обнаружения флуоресценции гель-проникающей хроматографии (фс). Мониторинг профиль гель-флуоресценции, GFP предоставляет информацию о моно-дисперсности и целостности мембранных белков в различных моющих средств. Белок: комбинации моющее средство, которое элюируют симметричный пик с мало свободного GFP и минимальной агрегации являются кандидатами для последующей очистки. По описанной методике, гетерологичная экспрессии в E. палочка СЭД (форма, относительное удлинение, разделение, и спорообразования) белков из 47 различных видов бактерий были проанализированы. Эти белки обычно имеют десять трансмембранных доменов и имеют важное значение для деления клеток. Результаты показывают, что производство SED, ортолагами в E. палочка была сильно варьируется по отношению к уровням экспрессии и целостности белков GFP синтеза. Эксперимент яdentified подмножество для дальнейшего расследования.
Было подсчитано, что мембранные белки составляют приблизительно 20-30% генов, кодируемых в геномах всех секвенированных 1, в том числе человеческого генома 2. Учитывая их решающую роль во многих биологических процессах, например для транспортных метаболитов, производства энергии и, как лекарственных препаратов, есть большой интерес в определении их трехмерную структуру. Однако по сравнению с растворимых белков, мембранные белки очень слабо представлены в белке банка данных. В самом деле, из 99 624 выпущенных структур в PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) только 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) классифицируются как мембранных белков. Это отражает технические трудности работы с мембранными белками, которые, естественно, высказанных на относительно низких уровнях; родопсина является одним из немногих исключений 3,4. За экспрессия рекомбинантного версиис в гетерологичных клетках часто приводит к неправильного сворачивания и плохой ориентации на мембране, который ограничивает общий уровень производства. Выбор наилучшего моющее средство для извлечения и солюбилизации мембранного белка в свое время высказал делает последующую очистку сложно и требует тщательного оптимизации.
Кишечной палочки остается наиболее часто используемым хост выражение для мембранных белков, приходящихся на 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) структур решена до сих которые почти исключительно из бактериальных источников. Удельный E. штаммы кишечной палочки, C41 (DE3) и C43 (DE3), были выделены, которые не приводят к чрезмерной экспрессии мембранных белков и, следовательно, избежать последствий токсичность наблюдается и для других BL21 штаммов 5,6. Настройка уровня экспрессии рекомбинантного белка мембраны по-видимому, важны для оптимизации уровня производства 6,7.
<p class="Jove_content"> Во многих случаях успешного производства мембранных белков для определения структуры потребовало оценку нескольких версий, включая амино- и карбоксильных-концевые делеции, несколько ортолагами с целью извлечения изменение естественной последовательности и различные слитые белки 6-8. Таким образом, способ скрининга экспрессии нескольких мембранных белков параллельно имеет важное значение. Один широко используемый подход к слиянию белка зеленого флуоресцентного белка (GFP), позволяющей экспрессии, которые необходимо отслеживать без необходимости очистки белка. Таким образом, информация о уровня экспрессии, стабильность и поведение в различных моющих средствах могут быть оценены с небольшими количествами не-очищенного материала 9-12.В этой статье мы расскажем, упорядоченных протокол для клонирования и экспрессии скрининга мембранных белков в E. палочка с помощью слияния в GFP в качестве репортера производства и последующей характеристики моющего средства: белка компlexes (Рисунок 1).
В методике, описанной в этой статье, лигирование независимое клонирование в GFP репортерного вектора в сочетании с флуоресцентной детекции быстро экран относительную экспрессию нескольких мембранных белков в E. палочка. Векторы могут быть сделаны в четырех рабочих дней с первичной скрининга выражение принимает дополнительно неделю. В-гель флуоресценции моющих лизатов целых клеток используется для ранжирования выражение парад для дальнейшего анализа в средней экране. Экран первичное выражение, как представлено не требует, кроме шейкер-инкубатор, пригодной для выращивания клеток в глубоких блоков также любое специальное оборудование. Все другие жидкости обработки с участием 96-а SBS пластины может быть осуществлена с использованием многоканальных пипеток. Протокол может быть легко модифицирован, чтобы включать в себя другие штаммов E.coli, выращенных в различных условиях экспрессии (например, ниже температура). В случае LEMO21 (DE3) титрованием уровень рамнозы (от 0 до 2,0 мм)добавлен, чтобы модулировать скорость транскрипции может повысить уровень экспрессии некоторых мембранных белков 7. Кроме DDM Моющие могут быть использованы для извлечения в основной экран, хотя более жесткие моющие средства могут солюбилизации белков из телец включения и, следовательно, дает ложных срабатываний. Очевидно, что чем сложнее начальный экран становится более трудоемким эксперимент.
Дополнительный экран включает подготовку общей мембранной фракции хитов экспрессии определенных в основной экран. Это очень важный шаг, поскольку он подтвердит локализацию слитых белков в мембраны Е. палочки клетки. После экстракции белка GFP слитого в различных моющих средствах будет контролироваться с помощью флуоресцентной-обнаружено эксклюзионной хроматографии растворенного вещества, чтобы оценить моно-дисперсность детергента-белковых комплексов. Это еще один важный шаг, поскольку он определяет наиболее подходящий стиральный порошок длясолюбилизации мембранного белка для последующей обработки вниз по течению. Тем не менее, опыт показывает, что дальнейшая оптимизация выбора моющего средства (ов) таки может потребоваться во время очистки и кристаллизации. Свидетельство единого поведения в различных моющих средств в том числе с относительно небольшим размером мицелл (например LDAO) появляется, чтобы быть хорошим индикатором склонности к образованию и дифракция, кристаллы, по крайней мере для прокариотических мембранных белков 14. В этом отношении профиль показан на мембранного белка на фиг.2В представляется весьма выгодно.
Основное преимущество использования GFP репортер, что она дает быстрое считывание экспрессии в образцах не-очищали. Недостатком является то, что белок GFP слитый должен быть удален в течение очистки белка дл кристаллизации. В случае векторов, используемых здесь, протеазы сайт риновирусов 3C обеспечивает расщепление GFP. С другой стороны, это простоповторно-Clone кандидатов белки, выявленных на экране, в векторы, которые добавляются только полигистидиновый или другой аффинной метки для последующей очистки. Это предполагает, что слитый с GFP не является необходимым для экспрессии. Основной альтернативой использованию сплав с GFP для обнаружения экспрессии белка мембраны и солюбилизации является добавление только гистидин тег. Однако этот подход, как правило, требует, начиная с мембранной фракции 15, которая для оценки многих вариантов стала бы очень много времени.
Таким образом, основная цель протокола, описанного в этой статье, для того, чтобы большое количество последовательности мембранных белков варианты, чтобы быстро оценить с точки зрения выражения и моющих средств солюбилизации и приоритеты для более глубокого анализа.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |