Une<em> Ex vivo</em> Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain
Summary
Nous avons développé un nouveau modèle ex vivo pour étudier l'action des hormones dans le sein humain. Il est basé sur les microstructures de tissu isolé à partir d'échantillons de tissus mammaires chirurgicales qui conservent l'architecture des tissus, des interactions intercellulaires, et la signalisation paracrine.
Abstract
L'étude de l'action des hormones dans le sein humain a été entravée par le manque de systèmes de modèles appropriés. Après culture in vitro, les cellules epitheliales mammaires primaires ont tendance à perdre l'expression du récepteur de l'hormone. Largement utilisés lignes cellulaires du cancer du sein positif du récepteur de l'hormone sont d'une pertinence limitée à la situation in vivo. Ici, nous décrivons un modèle ex vivo pour étudier l'action des hormones dans le sein humain. Spécimens humains frais de tissu mammaire à partir de matériaux de défausse chirurgicale tels que plasties mammaires de réduction ou mammectomies sont mécaniquement et digestion enzymatique pour obtenir des fragments de tissus contenant des conduits et des lobules et de multiples types de cellules stromales. Ces microstructures de tissus conservés dans le milieu de base sans facteurs de croissance conservent leurs contacts intercellulaires, l'architecture des tissus, et restent hormone sensible pendant plusieurs jours. Ils sont facilement traitées pour l'ARN et l'extraction des protéines, l'analyse histologique ou stockés dans un milieu de congélation. Fluorescencetri cellulaire activé (FACS) peut être utilisé pour enrichir les populations de cellules spécifiques. Ce protocole fournit une approche simple, standard pour les études translationnelles, avec des spécimens humains variés très complexes.
Introduction
Informations sur le paysage de mutation dans le cancer du sein est en augmentation à un rythme rapide. Moins d'attention a été accordée à des facteurs systémiques qui influent sur le développement du cancer du sein. L'exposition à des hormones de la reproduction a un impact majeur sur la progression de la maladie 1-3. Pourtant, les mécanismes par lesquels les hormones de la reproduction empiètent sur la poitrine humaine sont mal comprises. Travailler avec des modèles de souris génétiquement modifiées a révélé qu'ils impliquent Signalisation cellulaire intrinsèque et paracrine travers plusieurs effecteurs en aval 4.
La connaissance limitée de l'action des hormones dans le sein humain est en grande partie attribuable à un manque de modèles adéquats. La plupart des travaux sur les mécanismes de récepteur d'œstrogène (ER) et le récepteur de la progestérone (PR) de signalisation a été effectué avec des lignées cellulaires de récepteur d'hormone positifs du cancer du sein, telles que les cellules MCF-7 et T47D. Ceux-ci ont été dérivées des épanchements pleuraux chez des patients atteints d'un cancer du sein avancé qui avait already reçu de multiples traitements 5. La pertinence biologique de ces résultats dans les modèles in vitro simples du sein humain est inapproprié et gènes cibles identifiés dans plusieurs modèles in vitro sont diffèrent des gènes cibles qui sont identifiés dans les modèles animaux 6. Lorsque les cellules epitheliales mammaires humaines primaires sont cultivées in vitro, ils ont tendance à perdre l'expression des récepteurs hormonaux et donc sensible aux récepteurs hormonaux 7,8. Ce problème peut être circumventd par approches 3D sophistiqués utilisant matrigel. De cette manière, C. Clarke et ses collègues ont réussi à établir les cellules épithéliales mammaires qui ont maintenu l'expression des récepteurs hormonaux et ont montré une réponse proliferative à la stimulation de la progestérone 9. Cependant, deux important dans les gènes cibles du récepteur de la progestérone in vivo, Wnt-4 et RANKL, ne ont pas été induite par stimulation de la progestérone dans ce système 9. Cette approche a été récemment prise le plus loin avec in vitro </em> prétraitement de l'hormone et de RANKL induction a été atteint 10. Une mise en garde reste que matrigel a des activités qui sont indépendamment de la charge, est coûteux, et exige une conception expérimentale qui est apte pour les numéros à petites cellules seulement.
Partant du constat que, dans ER in vivo et la signalisation PR sont en grande partie médiée par des interactions paracrines 11, nous avons fait valoir que les interactions intercellulaires doivent être maintenus. Un autre facteur important qui est perdue sous forme de tissus sont dissociées aux cellules simples de culture in vitro sont les interactions entre les cellules épithéliales avec la matrice extracellulaire; pourtant ce sont cruciaux pour la différenciation épithéliale et leur rupture est important dans la tumorigenèse 12. Dans cet esprit, nous avons établi une méthode pour isoler microstructures des tissus du sein du matériau frais de défausse chirurgicale 13. Le parenchyme mammaire, constituée d'un épithélium en deux couches avec luminale intérieure et extérieure myoepithelicellules d'Al, est disséqué loin de tissu adipeux et soumis à la dissociation mécanique et enzymatique. Après lavage et centrifugation, des fragments de conduits de lait sont obtenus qui conservent interactions étroites avec de nombreuses cellules stromales. Ces microstructures des tissus restent sensibles aux hormones. Le modèle a été validé dans les échantillons cliniques 13. En tant que telle, la présente procédure peut aider à étudier l'action des hormones dans le sein dans un contexte biologique et clinique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La culture ex vivo décrit ici fournit des microstructures de tissus mammaires contenant des conduits et des lobules intactes, ainsi que d'autres types de cellules qui se trouvent normalement dans le sein de la femme humaine. Dans le traitement du tissu mammaire humain généralement obtenu à partir de plasties mammaires de réduction, l'élimination de tissu adipeux, la digestion mécanique et enzymatique de la matrice du stroma, et la lyse des globules rouges enrichit de fragments de conduit de lait …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient M. Fiche de l'hôpital universitaire de Lausanne pour fournir la photo de mammoplastie, M. Wirth et A. Ayyanan de l'Institut suisse de recherche expérimentale sur le cancer, Centre national de compétence en recherche en oncologie moléculaire, École des sciences de la vie, de l'Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne pour l'assistance technique et R. Clarke de l'Université de Manchester pour les commentaires critiques. Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du soutien de SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531 817, et l'entreprise commune Initiative médicaments innovants sous convention de subvention non. 115188, les ressources dont sont composées de contribution financière du Programme de l'Union européenne septième programme-cadre (FP7 / 2007-2013) et la Fédération européenne des industries et associations pharmaceutiques entreprises «contribution en nature. L'adresse Web de l'Initiative Médicaments Innovants est http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
Referências
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