Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Summary

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Abstract

Cellule stromali regolano il reclutamento dei leucociti circolanti durante l'infiammazione attraverso il cross-talk con le cellule endoteliali vicine. Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" de per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti dalla portata dalle cellule endoteliali infiammate. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiare il ruolo delle cellule stromali, in questo caso le cellule staminali mesenchimali (MSC), nel regolare il reclutamento dei leucociti.

Cellule endoteliali primarie sono state coltivate solo o insieme con MSC umana in contatto diretto sulla microslides Ibidi o su lati opposti di un filtro Transwell per 24 ore. Le colture sono state stimolate con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) per 4 ore e incorporati in un saggio di adesione a base di flusso. Un bolo di neutrofili è stato perfusosopra l'endotelio per 4 min. La cattura di fluire neutrofili e le loro interazioni con l'endotelio è stata visualizzata mediante microscopia in contrasto di fase.

In entrambi i modelli, citochine stimolazione aumentata endoteliale reclutamento di neutrofili scorre in modo dose-dipendente. Analisi del comportamento di neutrofili reclutati mostrato una riduzione dose-dipendente in rotolamento e un aumento dose-dipendente nella trasmigrazione attraverso l'endotelio. In co-coltura, MSC soppresso neutrofili all'endotelio TNF-stimolata.

I nostri modelli a base di adesione flusso imitano le fasi iniziali di reclutamento dei leucociti dalla circolazione. Oltre a leucociti, possono essere utilizzati per esaminare il reclutamento di altri tipi di cellule, come le cellule tumorali circolanti MSC o terapeuticamente somministrati. I nostri modelli di co-coltura multistrato hanno dimostrato che MSC comunicare con endotelio di modificare la loro risposta a citochine pro-infiammatorie, Altering il reclutamento dei neutrofili. Sono necessarie ulteriori ricerche utilizzando tali modelli per comprendere appieno le cellule stromali come di diversi tessuti e condizioni (malattie infiammatorie o il cancro) influenzano il reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione.

Introduction

L'infiammazione è una risposta protettiva alle infezioni microbiche o lesioni dei tessuti che richiede stretta regolamentazione dell'entrata dei leucociti e l'uscita dal tessuto infiammato per consentire la risoluzione ^1,2. Cross-talk tra cellule endoteliali (EC) che i vasi sanguigni linea, leucociti circolanti e cellule stromali tessuti residente è essenziale per coordinare questo processo ^3. Tuttavia, l'assunzione incontrollata di leucociti e loro liquidazione inefficace alla base dello sviluppo delle malattie infiammatorie croniche ^4. La nostra attuale comprensione del reclutamento dei leucociti in salute e malattia è insufficiente e sono necessari modelli più robusti per analizzare questo processo.

I meccanismi di sostegno al reclutamento dei leucociti dal sangue attraverso CE vascolare in venule post-capillari sono stati ben descritti ^1,2,5. Leucociti circolanti vengono catturati dai recettori specializzati (ad esempio, VCAM-1, E-selectina, P-selectina) chesono up-regolati su endotelio infiammata. Queste interazioni transitorie consentono leucociti di interagire con chemochine superficie vincolata e mediatori lipidici di derivazione (o endoteliali o stromali in origine) che attivano integrine espresse dai leucociti ^{6- 11.} Questo a sua volta stabilizza adesione e le unità di migrazione attraverso l'endotelio e nel tessuto ^{12- 15.} All'interno del tessuto, reclutati leucociti sono sottoposti a agenti stromali di derivazione che influenzano la loro motilità, funzione e la sopravvivenza ^16,17. Una crescente evidenza suggerisce fortemente che i segnali ricevuti in ogni fase delle condizioni di processo di reclutamento dei leucociti per il prossimo. Tuttavia, la nostra comprensione di reclutamento dei leucociti rimane incompleto e molto poco si sa circa il movimento dei leucociti componenti shaping all'interno del tessuto.

In Birmingham abbiamo sviluppato diversi modelli in vitro "vascolari" per studiare il reclutamento dei leucociti daflusso ^9,18,19. Ora capiamo che vascolare atto CE per quanto immediati regolatori di reclutamento dei leucociti rispondere ai cambiamenti nel loro microambiente locale. In particolare, le cellule stromali tessuti residenti possono regolare attivamente la risposta infiammatoria, in parte conversando con i paesi limitrofi CE vascolare di influenzare il loro ruolo nel reclutamento ^3. Abbiamo precedentemente dimostrato che varie cellule stromali modulano la capacità di CE di sostenere l'adesione e la migrazione di leucociti in modo tessuto-specifico, e che tali effetti diventare alterato nelle malattie croniche ^13,16,20,21. Così, le cellule stromali stabilire tessuto 'indirizzo codici "che definiscono il contesto di ogni risposta infiammatoria ^22. Più recentemente, abbiamo dimostrato che il midollo osseo derivate MSC (BMMSC) potentemente down-regolare la risposta della CE alle citochine, portando ad una riduzione del reclutamento di neutrofili e linfociti ^23.

I meccanismi govErning reclutamento chiarito in vitro hanno in gran parte utilizzato dosaggi incorporano un tipo singola cella (ad esempio, CE) o proteine ​​in isolamento. Tuttavia, questi studi non prendono in considerazione gli effetti dell'ambiente tessuto locale (cioè, la presenza di cellule stromali) sul reclutamento dei leucociti e la loro successiva migrazione nel tessuto. Qui si descrivono due metodi basati sul flusso in cui le cellule stromali, in particolare le cellule staminali mesenchimali (MSC), sono co-coltura con EC ^23. Tali modelli consentono di esaminare l'effetto delle cellule stromali sulle risposte endoteliali, in particolare la loro capacità di sostenere il reclutamento dei leucociti dal flusso.

Protocol

1. Isolamento e la coltura di cellule endoteliali umane primarie e cellule staminali mesenchimali Cellule isolamento e la coltura di umane ombelicali endoteliali vena (HUVEC): Mettere cordone ombelicale su un vassoio con carta assorbente e spruzzare con il 70% di etanolo. Mettere in una cappa coltura tissutale. Identificare la vena e cannulate ad entrambe le estremità. Posizionare una fascetta intorno alla fine cannulata per fissarlo. Lavare sangue venoso con PBS usando una siringa. Riempi…

Representative Results

Inizialmente, abbiamo analizzato l'effetto di stimolare CE con TNF sul reclutamento di neutrofili dal flusso utilizzando il modello MicroSlide Ibidi (Sezione 7 – 9). In assenza di TNFa, poca o nessuna neutrofili rispettate monostrato endoteliale (Figura 2A). Questo è stato previsto, come non trattata / riposo CE non esprimono le molecole necessarie adesione (selectine) o chemochine per sostenere vincolante 25,26. Al contrario, citochine stimolazione aumentato significati…

Discussion

Qui si descrive due vitro modelli "vascolari" de per studiare il reclutamento di neutrofili circolanti da endotelio infiammata. Un vantaggio importante di questi modelli è la capacità di analizzare ogni passo nella cascata leucociti in ordine, come avverrebbe in vivo. Abbiamo già osservato un aumento dose-dipendente in neutrofili adesione e la trasmigrazione attraverso TNF-stimolata CE ^9,29. Descriviamo inoltre come entrambi i modelli possono essere adattati per studiar…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.