Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Summary

Existen muchos métodos diferentes para la medición de las vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometría de flujo (FCM). Varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Se presentan dos protocolos para vehículos eléctricos de medición, usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas.

Abstract

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

Introduction

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

Vehículos eléctricos, también conocidas como micropartículas, son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que están involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos ^1. A través de la expresión de diversos marcadores de superficie y / o transferencia directa de material biológico, los vehículos eléctricos son capaces de alterar la función de las células receptoras para jugar ya sea activar o suprimir funciones en la comunicación intercelular ^2-4. EVs Clínicamente, los derivados de las plaquetas se sabe que tienen una fuerte actividad anticoagulante ^5, mientras que otros han demostrado que contribuyen a una amplia gama de condiciones, desde la promoción metasta tumorsis ⁶ a proteger contra la enfermedad ^7. EVs se pueden clasificar en categorías más pequeñas de las vesículas derivadas de células tales como los exosomas y microvesículas (MVs), dependiendo de su tamaño y el mecanismo de la generación de ^8. La nomenclatura de las subpoblaciones de vesículas derivadas de células sigue siendo un tema de debate en curso ^8,9, sin embargo, los exosomas se describen generalmente como pequeñas, de 40 a 100 nm partículas derivadas de la fusión endosomal con la membrana plasmática, mientras que MVs son más grandes de 100 a 1000 partículas nm formadas por el desprendimiento de la membrana plasmática ^10. Aquí, el término general "vehículos eléctricos" se utiliza para referirse a todos los tipos de vesículas biológicos extracelulares liberados por las células.

Aislamiento de los vehículos eléctricos de la sangre entera es un procedimiento multi-etapa y se han mostrado muchos diferentes variables de proceso para afectar el contenido EV, incluyendo la temperatura de almacenamiento y la duración ^11,12, anticoagulante / conservante utilizado ¹³ ymétodo de centrifugación utilizado ^14. Una necesidad de estandarización de estas variables ha llevado a las recomendaciones de la Sociedad Internacional de Trombosis y procesamiento de la sangre y de aislamiento EV procedimientos Hemostasia Comité Científico y Normalización (ISTH SSC) para su correcto ^15,16, todavía no existe un consenso entre los investigadores sobre el protocolo óptimo para utilizar ^12. La mayoría coincide, sin embargo, que las variables pre-analíticos muy controladas son cruciales para los datos exactos y reproducibles.

Para el análisis de los vehículos eléctricos, los investigadores han utilizado diversos métodos, incluyendo la microscopía electrónica de transmisión ^17, microscopía electrónica de barrido ^18,19, microscopía de fuerza atómica, luz dinámica de dispersión ^20,21 y occidental blot ^22,23. Mientras FCM es el método de elección para muchos investigadores ^{9,24 – 26} debido a sus capacidades de alto rendimiento, el análisis de los vehículos eléctricos utilizando FCM ha sidonotoriamente difícil debido a su tamaño y falta de poblaciones positivas discretos ^27-32. En comparación con el análisis de las células, el pequeño tamaño de los EVs resultados en 1) menos fluorescencia emitida debido al menor número de antígenos por partícula y 2) la viabilidad limitada de lavado post-mancha, que es necesaria para reducir la fluorescencia de fondo. Los desafíos comunes entre los investigadores incluyen señales que surgen de agregados de inmunoglobulinas ^27,28 y auto-agregación de anticuerpos ^29. Además, los tiempos de procesamiento largos y largos procedimientos de lavado / aislamiento utilizados por muchos de los protocolos actuales ^33,34 requieren compromisos de tiempo de varios días para analizar un pequeño número de muestras, haciendo que sea menos que ideal para aplicaciones de alto rendimiento. Algunos investigadores renuncian a un paso de lavado completo, haciendo controles negativos FCM utilizados tradicionalmente como menos fluorescencia uno (FMO) y isotipos de anticuerpos inútil para evaluar con precisión bacfluorescencia kground ^30.

Nuestros protocolos abordan tres problemas comunes que pueden impedir el análisis FCM adecuado de los vehículos eléctricos: Las señales derivadas de los agregados de anticuerpos y otros no-vesículas, dificultad para eliminar el anticuerpo no unido, y la falta de poblaciones positivos perceptibles. Las técnicas descritas aquí serán ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, relación señal a ruido creciente, y el establecimiento de puertas de una manera racional que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. Dos métodos de detección diferentes se presentan aquí: el primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

Protocol

NOTA: Los siguientes protocolos se han realizado en cumplimiento de todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todas las muestras de sujetos humanos se pusieron a prueba en virtud de una junta de revisión institucional (IRB) protocolo -aprobado y con el consentimiento informado de los sujetos. 1. MÉTODO A: Individual Método de detección 1.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos …

Representative Results

La Figura 1 describe el esquema general de procesamiento para el aislamiento y la detección de los vehículos eléctricos utilizando el método basado en perlas o método de detección individual. Detección individual de los vehículos eléctricos utilizando FCM trabaja bien para el análisis de los vehículos eléctricos más grandes, pero la mayoría de citómetros no son capaces de detectar individualmente partículas tan pequeñas como exosomas. Un enfoque basado en perlas permite pequeños …

Discussion

Se presentaron dos protocolos diferentes para el aislamiento, tratamiento y análisis de EVs, utilizando ya sea un individuo o de detección de enfoque basado en perlas. Al seleccionar el método más apropiado utilizar no siempre es sencillo y requiere una comprensión de la muestra a analizar, así como las subpoblaciones individuales de interés. Además, la sensibilidad de la citómetro utilizado para la adquisición se debe considerar al elegir el método más apropiado. A menudo no existe una única mejor protocol…

Materials

LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12×75 polystrene	BD Biosciences	352058
50mL Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips – 10µL	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200µL	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips – 1000µL	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230