Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie
Summary
Veel verschillende methoden bestaan voor de meting van extracellulaire blaasjes (EV) met flowcytometrie (FCM). Verschillende aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Twee protocollen voor het meten van EV's worden gepresenteerd, met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering.
Abstract
Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Hier gepresenteerde zijn verschillende technieken voor de verwerking van EV's en twee protocollen voor het analyseren van EV's met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering. De hier beschreven zal helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten werkwijzen toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten rationeel fashion dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode die bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kraal benadering te vangen en detecteren kleinere EV en exosomes.
Introduction
Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Hier gepresenteerde zijn verschillende technieken voor de verwerking van EV's en twee protocollen voor het analyseren van EV's met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering. De hier beschreven zal helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten werkwijzen toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten rationeel fashion dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode die bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kraal benadering te vangen en detecteren kleinere EV en exosomes.
EV's, ook wel bekend als microdeeltjes, zijn klein, membraan-afgeleide blaasjes aangetroffen in lichaamsvloeistoffen die betrokken zijn bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen 1. Door expressie van diverse oppervlakte markers en / of rechtstreekse overdracht van biologisch materiaal, EV kunnen de functie van ontvangende cellen veranderen spelen ofwel activeren of onderdrukken rollen in intercellulaire communicatie 2-4. Klinisch bloedplaatjes afgeleide EV bekend sterke anticoagulerende activiteit 5 hebben, terwijl andere zijn aangetoond te dragen aan een breed scala aan omstandigheden, het bevorderen van tumor metastasis 6 aan het beschermen tegen de ziekte 7. EV's kunnen worden onderverdeeld in kleinere groepen van cellen afgeleide blaasjes zoals exosomes en microvesicles (MV), afhankelijk van hun grootte en het mechanisme van de generatie 8. De nomenclatuur van de cel afkomstige vesikel subpopulaties steeds een onderwerp van debat 8,9, echter, exosomes algemeen beschreven als kleine, 40 tot 100 nm deeltjes afkomstig van endosomale fusie met de plasmamembraan, terwijl MV groter 100 tot 1000 nm deeltjes gevormd door het afstoten van de plasmamembraan 10. Hier wordt de algemene term "EV" worden gebruikt voor alle soorten van extracellulaire biologische blaasjes vrijgegeven door cellen.
Isolatie van EV uit volbloed een meerstaps procedure en vele bewerkingsvariabelen is aangetoond EV inhoud, waaronder opslagtemperatuur en duur 11,12, antistollingsmiddel / conserveermiddel gebruikt 13 en beïnvloedencentrifugatie methode 14. Een behoefte aan standaardisatie van deze variabelen heeft geleid tot de aanbevelingen van de International Society op trombose en hemostase Wetenschappelijk Comité en normalisatie (ISTH SSC) voor een correcte verwerking van bloed en EV isoleringsprocedures 15,16, maar er bestaat geen consensus tussen onderzoekers op het optimale protocol gebruik 12. Meest echter over eens dat strak pre-analytische variabelen zijn cruciaal voor nauwkeurige en reproduceerbare gegevens.
Om EV's te analyseren, hebben de onderzoekers gebruik gemaakt van verschillende methoden, met inbegrip van transmissie elektronenmicroscopie 17, scanning elektronenmicroscopie 18,19, atomic force microscopie, dynamische lichtverstrooiing 20,21 en western blotting 22,23. Terwijl FCM is de voorkeursmethode voor veel onderzoekers 9,24 – 26 vanwege de hoge doorvoer capaciteit, analyse van EV gebruik FCM geweestnotoir moeilijk vanwege hun grootte en het ontbreken van discrete positieve populatie 27-32. Vergeleken analyse van cellen, de kleine afmeting van de EVS leidt 1) minder fluorescentie geëmitteerd door het kleinere aantal antigenen per deeltje en 2) beperkte haalbaarheid van post-vlek wassen, nodig om achtergrondfluorescentie te verminderen. Gemeenschappelijke uitdagingen onder onderzoekers onder meer signalen die voortvloeien uit immunoglobuline aggregaten 27,28 en zelf-aggregatie van antilichamen 29. Bovendien is de lange doorlooptijden en langdurige wassen / isolatieprocedures gebruikt door veel van de huidige protocollen 33,34 vereisen meerdaagse tijdverplichtingen een klein aantal te analyseren, waardoor ze minder dan ideaal voor high throughput toepassingen. Sommige onderzoekers af te zien van een wasstap helemaal, waardoor traditioneel gebruikt FCM negatieve controles, zoals fluorescentie min één (FMO) en antilichaamisotypen nutteloos voor nauwkeurig te beoordelen background fluorescentie 30.
De protocollen richten drie gemeenschappelijke problemen juiste FCM analyse van EV kan belemmeren: signalen die door antilichaam aggregaten en andere niet-vesicles, moeilijk verwijderen van ongebonden antilichaam en het gebrek aan waarneembare positieve populaties. De hier beschreven technieken zullen helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten, toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten beredeneerd dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Twee verschillende detectiemethoden worden hier gepresenteerd: het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode is bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kralen gebaseerde methode voor de weergave en sporen kleiner EV en exosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Twee verschillende protocollen voor de isolatie, de behandeling en analyse van EV's werden gepresenteerd, met behulp van een individuele opsporing of-bead gebaseerde aanpak. Het selecteren van de meest geschikte methode te gebruiken is niet altijd eenvoudig en vereist een goed begrip van het monster wordt ook getest als de individuele subpopulaties van belang. Bovendien moet de gevoeligheid van de cytometer voor verwerving worden overwogen bij het kiezen van de meest geschikte methode. Vaak is er geen enkele beste p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dale Hirschkorn van Blood Systems Research Institute bedanken voor zijn hulp bij doorstroomcytometer instrument instellingen. Dit werk werd ondersteund door NIH verleent HL095470 en U01 HL072268 en DoD contracten W81XWH-10-1-0023 en W81XWH-2-0028.
Materials
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
Referências
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation–and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -. M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Pesquisa do Câncer. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -. F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -. M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
