Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Summary

Mange forskjellige fremgangsmåter eksisterer for måling av ekstracellulære vesikler (kjøretøyer) ved hjelp av strømningscytometri (FCM). Flere aspekter bør vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. To protokoller for måle elbiler presenteres, enten ved hjelp av individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming.

Abstract

Ekstracellulære Blemmer (elbiler) er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er svært involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser. Analyse av elbiler bruker flowcytometri (FCM) har vært notorisk vanskelig på grunn av sin lille størrelse og mangel på diskrete populasjoner positive for markører av interesse. Metoder for EV analyse, mens betydelig forbedret de siste ti årene, er fortsatt et arbeid som pågår. Dessverre, det er ingen one-size-fits-all-protokollen, og flere aspekter må vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. Presenteres her er flere forskjellige teknikker for behandling elbiler og to protokoller for å analysere elbiler ved hjelp av enten individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming. Metodene som beskrives her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater som vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og innstillings portene i en rasjonell fashion som minimerer påvisning av bakgrunnen fluorescens. Den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perle basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.

Introduction

Ekstracellulære Blemmer (elbiler) er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er svært involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser. Analyse av elbiler bruker flowcytometri (FCM) har vært notorisk vanskelig på grunn av sin lille størrelse og mangel på diskrete populasjoner positive for markører av interesse. Metoder for EV analyse, mens betydelig forbedret de siste ti årene, er fortsatt et arbeid som pågår. Dessverre, det er ingen one-size-fits-all-protokollen, og flere aspekter må vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. Presenteres her er flere forskjellige teknikker for behandling elbiler og to protokoller for å analysere elbiler ved hjelp av enten individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming. Metodene som beskrives her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater som vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og innstillings portene i en rasjonell fashion som minimerer påvisning av bakgrunnen fluorescens. Den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perle basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.

Elbiler, også kjent som mikropartikler, er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser ^1. Ved ekspresjon av forskjellige overflatemarkører og / eller direkte overføring av biologisk materiale, EV er i stand til å endre funksjonen av mottakercellene til å spille enten aktivere eller undertrykke roller i intercellulær kommunikasjon ^{2 – 4.} Klinisk platederivert EV er kjent for å ha sterk antikoagulerende aktivitet ^5, mens andre har vist seg å bidra til et bredt spekter av tilstander, fra å fremme tumor metastasis ⁶ til å beskytte mot sykdom ^7. Elbiler kan klassifiseres i mindre kategorier av celle-stammer vesikler som exosomes og mikrovesikler (MV), avhengig av størrelse og mekanisme generasjon ^8. Nomenklaturen av celle-avledet vesikkel subpopulasjoner fortsetter å være et emne for debatt ^8,9, men exosomes er generelt beskrevet som små, 40 til 100 nm-partikler avledet fra endosomale fusjon med plasmamembranen, mens MV er større 100 til 1000 nm partikler dannet ved utstøtingen av plasmamembranen ^10. Her vil den generelle termen "elbiler" brukes til å referere til alle typer ekstracellulære biologiske vesikler utgitt av celler.

Isolering av el-biler fra helblod er en flertrinns fremgangsmåte og mange forskjellige prosessvariable har vist seg å påvirke EV innhold, inkludert lagringstemperatur og varighet ^11,12, antikoagulant / konserveringsmiddel som brukes, og ¹³sentrifugeringsmetoden brukes ^14. Et behov for standardisering av disse variablene har ført til anbefalinger fra International Society på Trombose og Haemostasis Vitenskapelige og Standardisering Committee (ISTH SSC) for skikkelig blod prosessering og EV isolasjonsprosedyrer ^15,16, men det finnes ingen enighet blant forskere om den optimale protokollen å bruke ^12. De fleste er imidlertid enige om at tett kontrollert pre-analytiske variabler er avgjørende for nøyaktige og reproduserbare data.

For å analysere elektriske biler, har forskere benyttet forskjellige metoder, inkludert transmisjonselektronmikroskopi ^17, scanning elektronmikroskopi ^18,19, atomkraftmikroskopi, dynamisk lysspredning ^20,21 og western-blotting ^22,23. Mens FCM er metoden for valg for mange forskere ^{9,24 – 26} på grunn av sin store gjennomgangs evner, har analyse av elbiler bruker FCM værtnotorisk vanskelig på grunn av deres størrelse og mangel på adskilte positive populasjoner ^27-32. Sammenlignet med analyser av celler, til den lille størrelsen av EVS resulterer i 1) mindre fluorescens avgitt på grunn av det mindre antall antigener per partikkel og 2) begrenset muligheten for post-flekk vasking, noe som er nødvendig for å redusere bakgrunnsfluorescens. Felles utfordringer blant forskere inkluderer signaler som kommer fra immunglobulinaggregater ^27,28 og selv aggregering av antistoffer ^29. Videre er lang saksbehandlingstid og lange vask / isolering prosedyrer som brukes av mange av de aktuelle protokollene ^33,34 krever multi-dagers tid forpliktelser til å analysere et lite antall prøver, noe som gjør dem mindre enn ideell for programmer med høy gjennomstrømning. Noen forskere avkall en vasketrinn helt, rende tradisjonelt brukt FCM negative kontroller som fluorescens minus én (FMO) og antistoffisotypene ubrukelig for nøyaktig vurdering av background fluorescens ^30.

Våre protokoller adressere tre vanlige problemer som kan hemme riktig FCM analyse av elbiler: signaler som oppstår ved antistoff aggregater og andre ikke-blemmer, vanskeligheter med å fjerne ubundet antistoff, og mangel på bare positive populasjoner. De teknikker som er beskrevet her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og å sette portene på en rasjonell måte som minimerer påvisning av bakgrunnsfluorescens. To forskjellige deteksjonsmetoder presenteres her: den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perler basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.

Protocol

MERK: Følgende protokoller er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Alle menneskelige lagt prøvene ble testet under en Institutional Review Board (IRB) -godkjent protokoll og med informert samtykke av fagene. 1. METODE A: Individuell Detection Method 1.1) Behandling av Blood Sample / Isolering av elbiler Trekke blod fra donor / pasient inn i to 10 ml glassrør inneholdende 1,5 ml …

Representative Results

Figur 1 skisserer den generelle prosesseringsskjema for isolering og påvisning av el-biler enten ved hjelp av kulebasert metode eller individuelle påvisningsmetode. Individuell påvisning av elbiler bruker FCM fungerer godt for å analysere større elbiler, men de fleste cytometere er ikke i stand til individuelt detektere partikler så små som exosomes. En kulebasert tilnærming tillater små EV som skal detekteres, men det er ulemper forbundet med å bruke denne metoden, som beskrevet i <stro…

Discussion

To forskjellige protokoller for isolering, behandling og analyse av elbiler ble presentert, ved hjelp av enten en enkeltperson påvisning eller perle basert tilnærming. Velge den mest hensiktsmessige metoden å bruke er ikke alltid enkel og krever en forståelse av prøven blir testet samt de enkelte subpopulasjoner av interesse. Videre må følsomheten av cytometer som brukes for anskaffelse tas i betraktning ved valg av den mest hensiktsmessige metode. Ofte er det ingen enkelt beste protokoll som brukes, snarere en k…

Materials

LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12×75 polystrene	BD Biosciences	352058
50mL Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips – 10µL	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200µL	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips – 1000µL	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230