उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड का उपयोग माउस भ्रूण में कंट्रास्ट इमेजिंग
Summary
यहाँ, हम जीवन में अल्ट्रासाउंड microbubble विपरीत एजेंटों, पृथक देर हमल चरण murine भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस विधि छिड़काव मापदंडों की और इसके विपरीत-बढ़ाया उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग भ्रूण के भीतर संवहनी आणविक मार्कर के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है।
Abstract
Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.
Introduction
विपरीत बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इमेजिंग कल्पना और संवहनी पर्यावरण चिह्नित करने के लिए microbubble विपरीत एजेंटों का उपयोग करता है। इन एजेंटों microcirculation में, vascularity और हृदय समारोह की noninvasive आकलन कर सकें। इसके अलावा, बुलबुला सतह के संशोधन संभव संवहनी घटनाओं की आणविक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग बनाने एंजियोजिनेसिस, atherosclerosis और सूजन 1,2 के पूर्व नैदानिक अनुप्रयोगों में प्रदर्शन के रूप में, endothelial बायोमार्कर के लिए बाध्य लक्षित microbubble में परिणाम कर सकते हैं। कंट्रास्ट बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इसलिए स्वस्थ और रोगग्रस्त संवहनी राज्यों 3-5 प्रभावित करती है कि जटिल और विविध वातावरण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
वर्ष के पिछले संख्या में, microbubble इमेजिंग की उपयोगिता में ब्याज बहुमुखी माउस भ्रूण मॉडल के लिए बढ़ा दिया गया है। स्तनधारी विकास का एक मॉडल के रूप में, भ्रूण वाहिका में microbubbles की शुरूआत शारीरिक बढ़ाताविकासशील संचार प्रणाली (उदाहरण के लिए, रक्त प्रवाह, कार्डियक आउटपुट) और ट्रांसजेनिक के मामलों और हृदय रोग 6,7 के लक्षित उत्परिवर्ती माउस मॉडल में, का अध्ययन हृदय समारोह में परिवर्तन कैसे आनुवंशिक कारणों में अंतर्दृष्टि उपज हो सकती है। वास्तव में, मात्रात्मक और गुणात्मक 2D भ्रूण मस्तिष्क वाहिका संरचना का विश्लेषण करती है जो पहले से ही आठ हासिल किया गया है। इसके अलावा, माउस भ्रूण विवो में संवहनी मार्करों के लिए लक्षित microbubbles के बंधन की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में प्रस्तुत करता है। Bartelle एट अल। 9, उदाहरण के लिए, Biotag-बीरा ट्रांसजेनिक भ्रूण में बंधन और नाड़ी शरीर रचना की जांच लक्षित आकलन करने के लिए भ्रूण हृदय निलय में avidin microbubbles शुरू की है। क्लिनिक के लिए इस तकनीक का अनुवाद करने में एक महत्वपूर्ण बेंचमार्क – विषमयुग्मजी और समयुग्मक माउस मॉडल की पीढ़ी भी आणविक अल्ट्रासाउंड के मात्रात्मक प्रकृति को परिभाषित करने के लिए लक्ष्य ट्यूमर मॉडल के अध्ययन के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
<p clगधा = "jove_content"> microbubbles सबसे अक्सर एक laparotomy 10/08 के माध्यम से अवगत कराया एकल भ्रूण में इंट्रा-हृदय इंजेक्शन के माध्यम से भ्रूण संचलन के लिए पेश कर रहे हैं। utero इंजेक्शन में, हालांकि, अनेक चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। ये इंजेक्शन मार्गदर्शन, माँ और exteriorized भ्रूण में गति का मुकाबला करने की जरूरत है, माँ में hemodynamic व्यवहार्यता के रखरखाव और 11 से खून बह रहा की वजह से संज्ञाहरण और जटिलताओं के दीर्घकालिक प्रभावों को संबोधित exteriorized भ्रूण, शामिल हैं। इसलिए, जांच के लक्ष्य को अलग-थलग रहने की देर चरण भ्रूण 12 में microbubbles इंजेक्शन लगाने के लिए एक तकनीक विकसित करने के लिए किया गया था। यह विकल्प इंजेक्शन नियंत्रण और स्थिति, रुकावट के बिना इमेजिंग विमान के reproducibility, और सरल छवि विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के मामले में अधिक स्वतंत्रता प्रदान करता है।वर्तमान अध्ययन में, हम के लिए रहने वाले murine भ्रूण में microbubbles के इंजेक्शन के लिए एक उपन्यास प्रक्रिया की रूपरेखा तैयारआर microbubble गतिज व्यवहार का अध्ययन करने के लिए और के प्रयोजनों के अंतर्जात endothelial सतह मार्करों के लिए बाध्य microbubble लक्षित का अध्ययन। गैर रेखीय विपरीत विशिष्ट अल्ट्रासाउंड इमेजिंग शिखर वृद्धि (पीई), धोने दर में और समय अलग E17.5 भ्रूण में (टीटीपी) शिखर सहित बुनियादी छिड़काव मापदंडों के एक नंबर के उपाय करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम यह भी वजह से सक्रिय एंजियोजिनेसिस 13 की साइटों पर संवहनी endothelial कोशिकाओं में अपनी उच्च अभिव्यक्ति के लिए endoglin एक नैदानिक प्रासंगिक लक्ष्य है जहां समारोह ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, का एक भ्रूण endoglin नुकसान में आणविक अल्ट्रासाउंड के मात्रात्मक प्रकृति का आकलन करने के लिए भ्रूण मॉडल की वैधता का प्रदर्शन । endoglin-लक्षित, (एमबी ई) चूहा निर्धारण आईजीजी दो नियंत्रण (एमबी सी) और अलक्षित (एमबी यू) microbubbles के आसंजन विषमयुग्मजी endoglin (इंग्लैंड +/-) और समयुग्मक endoglin (इंग्लैंड + / +) व्यक्त भ्रूण में मूल्यांकन किया जाता है। लक्षित बिंदी का विश्लेषणएनजी आणविक अल्ट्रासाउंड endoglin जीनोटाइप के बीच फर्क और quantifiable आणविक अल्ट्रासाउंड स्तर तक रिसेप्टर घनत्व से संबंधित करने में सक्षम है कि पता चलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों देर चरण हमल माउस भ्रूण और nonlinear विपरीत छवियों में इंजेक्शन थे छिड़काव मापदंडों को मापने के लिए अधिग्रहण कर लिया और बाध्यकारी microbubble निशाना बनाया गया। भ्रूण vasculature के भीतर microbubbles क…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.
Materials
| Reagents | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Antibodies (biotinylated, eBioscience) | Antibody choice depends on the experiment | ||
| rat isotype IgG2 control | eBioscience | 13-4321-85 | This antibody/microbubble combination is often required as experimental control |
| biotin anti-mouse CD309 | eBioscience | 13-5821-85 | |
| Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin | In house hybridoma | Outside antibodies may also be appropriate: we have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past | |
| Distilled water | |||
| Embryo media | |||
| 500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose | Sigma | D5796 | |
| 50 mL Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
| Hepes | Gibco | 15630 | 5mL, 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep |
| Ethanol, 70% | |||
| Ice | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | 4% |
| Phosphate Buffered Saline [1x] | Sigma | D8537 | 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride |
| Pregnant mouse, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0.9% sodium chloride (saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
| Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Cell culture plates (4) : 100×20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Cell culture plates (12) : 60×15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT centrifuge | ||
| Conical tubes, 50 mL BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluent | Beckman Coulter | Isoton II Diluent, 8448011 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Forceps, splinter | VWR | 25601-134 | |
| Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament | Narishige | GD-1 | |
| Glass needle puller | Narishige | PN-30 | |
| Gloves | Ansell | 4002 | |
| Gross anatomy probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hot plate | VWR | 89090-994 | |
| Ice bucket | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imaging Platform | VisualSonics Inc. | Integrated Rail System | |
| Light source, fiber-optic | Fisher Scientific | 12-562-36 | Ideally has adjustable arms |
| Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Micro-ultrasound system, high-frequency | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Needles, 21 gauge (1”) | VWR | 305165 | |
| Particle size analyzer | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Perforated spoon (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] | Eppendorf | Research Plus adjustable 3120000038; 3120000054; 3120000062 | |
| Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
| Scissors | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” | VWR | 63010-007 | |
| Wooden applicator stick (swab, cotton head) | VWR | CA89031-270 | |
| Surgical microscope 5-8x magnification | Fisher Scientific | Steromaster | |
| Syringes, 1 mL Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Syringes (10), 30 mL | VWR | CA64000-041 | |
| Syringe infusion pump | Bio-lynx | NE-1000 | |
| Thermometer, -20-110oC | VWR | 89095-598 | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Tube racks (3) | VWR | 82024-462 | |
| Ultrasound transducer, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, angled up | Fine Science Tools | 15005-08 |
Referências
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