De bioconjugatie en radiosynthese van⁸⁹ Zr-DFO-gemerkte antilichamen

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

De uitzonderlijke affiniteit, specificiteit en selectiviteit van antilichamen maken ze bijzonder aantrekkelijk vectoren voor tumor gerichte PET radiofarmaca. Door hun meerdaagse biologische halfwaardetijd, moet antilichamen met positron emitterende radionucliden met relatief lange fysieke verval halfwaardetijden worden gelabeld. Traditioneel, de positron emitterende isotopen ¹²⁴ I (t _1/2 = 4,18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 uur) en ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 uur) gebruikt om antilichamen te labelen PET beeldvorming. Meer recent is echter het veld is getuige een dramatische toename van het gebruik van de positron emitterende radiometaal ⁸⁹ Zr in antilichamen gebaseerde PET beeldvorming. ⁸⁹ Zr is een nagenoeg ideaal radioisotoop PET beeldvorming met immunoconjugaten, als het product heeft een fysische halveringstijd -leven (t _1/2 = 78,4 uur) die verenigbaar is met de in vivo farmacokinetiek van antilichamen en zendt een relatief lage energy positron dat hoge resolutie beelden produceert. Bovendien kunnen antilichamen ronduit worden gemerkt met ⁸⁹ Zr behulp van de-siderofoor afgeleid chelator desferrioxamine (DFO). In dit protocol wordt het prostaatspecifiek membraan antigen gericht antilichaam J591 worden gebruikt als een modelsysteem illustreert (1) de bioconjugatie van de bifunctionele chelator DFO-isothiocyanaat met een antilichaam, (2) de radiosynthese en zuivering van ⁸⁹ Zr- DFO-mAb radioimmunoconjugaat, en (3) In vivo PET beeldvorming met een ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugaat in een muismodel van kanker.

Introduction

Vanwege hun opmerkelijke gevoeligheid, affiniteit en selectiviteit zijn antilichamen lang beschouwd als veelbelovend vectoren voor de afgifte van radio-isotopen kankercellen. Echter hun toepassing in positron emissie tomografie (PET) beeldvorming belemmerd door het ontbreken van een geschikte positron emitterende radio-isotopen voor etikettering. ^1-3 Eén van de belangrijkste overwegingen bij het ​​ontwerpen van radioimmunoconjugaten is matching de fysieke verval half- levensduur van de radio-isotoop voor de in vivo farmacokinetiek van het antilichaam. Meer specifiek antilichamen vaak relatief lange meerdaagse biologische halfwaardetijden en dienen derhalve met radioisotopen met vergelijkbare fysische halfwaardetijd worden gelabeld. Voor PET-imaging-toepassingen, hebben antilichamen oudsher radioactief gemerkt geweest met ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 uur), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 uur), of ¹²⁴ I (t _1/2 = 4.18 d). ^{4, 5} Echter, elk vandeze radio-isotopen bezit belangrijke beperkingen die hun geschiktheid voor klinische beeldvorming belemmeren. Terwijl radioimmunoconjugaten gelabeld met ⁸⁶ Y en ⁶⁴ Cu veelbelovend preklinische onderzoeken hebben aangetoond, zowel isotopen bezitten de fysische halfwaardetijd te korte effectief voor beeldvorming bij de mens zijn. ¹²⁴ I daarentegen een bijna ideale fysische halfwaardetijd beeldvorming met antilichamen, maar het is duur en heeft suboptimale verval eigenschappen die leiden tot relatief lage resolutie ziektebeelden. Bovendien kan ^124-gemerkte radioimmunoconjugaten gelden dehalogenering in vivo, een proces dat tumor-tot-achtergrond activiteit verhoudingen kunnen verlagen. ^6,7

De rit naar een positron emitterende radio-isotoop te verdringen ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y vinden, en ¹²⁴ ik in radioimmunoconjugaten heeft de recente stijging van onderzoek aangewakkerd op ⁸⁹ Zr-gelabelde antilichamen. ^8-12 THij reden voor de komst van ⁸⁹ Zr is eenvoudig: het radiometaal bezit bijna ideaal chemische en fysische eigenschappen voor gebruik in diagnostische PET radioimmunoconjugaten ^{13 89} Zr wordt geproduceerd via de ⁸⁹ Y (p, n) ⁸⁹ Zr reactie op een cyclotron met een. commercieel verkrijgbaar en 100% natuurlijk voorkomende ⁸⁹ Y doel. ^14,15 De radiometaal een positron opbrengst van 23%, vervalt met een halfwaardetijd van 78,4 uur en zendt positronen met relatief lage energie van 395,5 keV (figuur 1). ^13,16,17 Het is belangrijk op te merken dat ⁸⁹ Zr geeft ook een hoge energie 909 keV γ-ray 99% rendement. Hoewel deze emissie niet energetisch bemoeien met de uitgezonden 511 keV fotonen, is het nodig extra aandacht met betrekking tot transport, handling, en dosimetrie. Ondanks dit voorbehoud kan bederf eigenschappen uiteindelijk dat ⁸⁹ Zr niet alleen een gunstiger half-leven voor beeldvorming met antilichamen dan ⁸⁶ Y en ⁶⁴ Cu maar kunnen ook hogere resolutie beelden dan ¹²⁴ I, die positronen uitzendt met hogere energieën van 687 en 975 keV en een aantal fotonen met energieën in 100-150 keV van de 511 keV-positron gemaakt fotonen. ¹³ Voorts, ⁸⁹ Zr is ook veiliger te hanteren, minder duur om te produceren, en residualizes in tumoren effectiever dan de radioactieve tegenhanger. ^18,19 Een mogelijke beperking van ⁸⁹ Zr is dat het niet hoeft een therapeutisch isotopoloog, bijvoorbeeld ⁸⁶ Y (PET) vs. ⁹⁰ Y (therapie). Dit voorkomt de opbouw van chemisch identieke, surrogaat beeldvormende middelen die kunnen worden toegepast als dosimetrische scout hun therapeutische tegenhangers. Dat gezegd hebbende, onderzoeken suggereren dat ⁸⁹ Zr-gelabelde antilichamen hebben potentieel als beeldvorming surrogaten voor ⁹⁰ Y- en ¹⁷⁷ Lu-gelabeld immuunconjugaten.^20,21

Vanuit chemisch oogpunt, een groep IV metaal, ⁸⁹ Zr bestaat als een 4 kation in waterige oplossing. De Zr ⁴⁺ ion is zeer geladen, relatief groot (effectieve ionenradius = 0,84 Å), en kan worden aangemerkt als een "harde" catie. Als zodanig vertoont een voorkeur voor liganden dragen maximaal acht harde, anionisch zuurstof donoren. Gemakkelijk de meest voorkomende chelator gebruikt in ⁸⁹ Zr-gemerkte radioimmunoconjugaten is desferrioxamine (DFO), een siderophore afgeleide acyclische chelator dragende drie hydroxamaat groepen. De ligand stabiel coördineert de Zr ⁴⁺ kation snel en zuiver bij kamertemperatuur in biologisch relevante pH, en het verkregen Zr-DFO complex blijft stabiel in de loop van meerdere dagen in zoutoplossing, bloed serum, en volbloed. ²² Computational studies suggereren sterk dat DFO vormt een hexagecoördineerd complex met Zr ⁴⁺ waarbij het ​​metaalcentrum gecoördineerd om de drie neutral en drie anionische zuurstof donors van het ligand en twee exogene water liganden (Figuur 2). ^23,24 De in vivo gedrag van radioimmunoconjugaten gebruik ⁸⁹ Zr-DFO conjugatie scaffold is over het algemeen uitstekend. In sommige gevallen, beeldvorming en acute biodistributie studies hebben verhoogde activiteit in de botten van muizen geïnjecteerd met ⁸⁹ Zr-gemerkte antilichamen, gegevens blijkt dat de osteophilic ⁸⁹ Zr ⁴⁺ kation vrijkomt uit de chelator in vivo en vervolgens Hermineraliseert geopenbaard in het bot. ²⁵ Onlangs is een aantal onderzoeken naar de ontwikkeling van nieuwe ⁸⁹ Zr ⁴⁺ chelatoren bijzonder liganden met acht zuurstof donors zijn verschenen in de literatuur. ^24,26,27 echter momenteel DFO is de meest toegepaste chelator in ⁸⁹ Zr gelabeld radioimmunoconjugaten met een ruime marge. Een verscheidenheid van verschillendebioconjugatie strategieën zijn gebruikt om DFO hechten aan antilichamen, waaronder bioorthogonal click chemie, de reactie van thiol reactieve DFO constructen met cysteïnen in het antilichaam en de reactie van geactiveerde ester dragende DFO constructen met lysinen in het antilichaam. ^{4,28- 30} Gemakkelijk de meest algemene strategie, echter is het gebruik van een isothiocyanaat dragende derivaat van DFO DFO-NCS (figuur 2). ²² Deze handel verkrijgbaar bifunctionele chelator robuust en betrouwbaar vormt stabiele, covalente bindingen thioureum met de lysinen van de antilichaam (Figuur 3).

De afgelopen jaren zijn diverse ⁸⁹ Zr-DFO-gelabelde radioimmunoconjugaten gerapporteerd in de literatuur. Preklinische onderzoeken bijzonder overvloedig zijn, die antilichamen variëren van de meer bekende cetuximab, bevacizumab, en trastuzumab meer esoterische antilichamen zoals T-CD105 targetingRC105 en fPSA-targeting 5A10. ^30-36 Meer recent, een klein aantal van de vroege fase van klinisch onderzoek met ⁸⁹ Zr-DFO-gelabelde antilichamen naar voren zijn gekomen in de literatuur. Concreet groepen in Nederland hebben gepubliceerde studies in dienst ⁸⁹ Zr-DFO-cmAb U36, ⁸⁹ Zr-DFO-ibritumomabtiuxetan, en ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 Daarnaast is er een reeks andere klinische studies met ⁸⁹ Zr-gelabelde radioimmunoconjugaten zijn momenteel aan de gang, met inbegrip van onderzoek hier in het Memorial Sloan Kettering Cancer Center met behulp van het PSMA-targeting ⁸⁹ Zr-DFO-J591 voor prostaatkanker beeldvorming en de HER2-targeting ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab voor borstkanker beeldvorming. ^{23, 30} Bovendien, terwijl radiogelabelde antilichamen blijven de meest voorkomende ⁸⁹ Zr-gemerkte radiofarmaceutica, het radiometaal ook steeds meer gebruikt met andere vectoren, zoals peptiden, proteïnen en nanomaterialen. ^38-43 </sup>

De modulariteit van deze ⁸⁹ Zr-DFO etikettering methodiek is een enorme aanwinst. Het repertoire van-biomarker targeting antilichamen is steeds groeiende, en de belangstelling voor het uitvoeren van in vivo PET beeldvorming met deze constructen wint steeds meer terrein. Hierdoor wij dat de ontwikkeling van gestandaardiseerde werkwijzen en protocollen het veld kunnen profiteren. Een uitstekende schriftelijke experimentele protocol voor DFO-NCS vervoeging en ⁸⁹ Zr radiomerking is al gepubliceerd door Vosjan, et al. ²² We hebben het gevoel dat de visuele demonstratie die door dit werk verder zou kunnen helpen onderzoekers nieuw voor deze technieken. In het protocol bij de hand, zal het prostaatspecifiek membraan antigen gericht antilichaam J591 worden gebruikt als een modelsysteem illustreert (1) de bioconjugatie van de bifunctionele chelator DFO-isothiocyanaat met een antilichaam, (2) de radiosynthese en zuivering van de ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugaat,en (3) In vivo PET beeldvorming met ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugaat in een muismodel van kanker. ^23,44,45

Protocol

Alle van de in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurd protocol en onder de ethische richtlijnen van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Vervoeging van DFO-NCS naar J591 In een 1,7 ml microcentrifugebuis bereiden 2-5 mg / ml oplossing van J591 in 1 ml van ofwel 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) of 0,5 M HEPES buffer (pH 7,4). Los DFO-NCS in droog DMSO bij een …

Representative Results

De eerste stap in dit protocol de vervoeging van DFO-NCS aan het antilichaam is meestal vrij robuust en betrouwbaar. In het algemeen kan de gezuiverde-chelator gemodificeerde immunoconjugaat verkregen in> 90% opbrengst en met 3 molaire equivalenten van DFO-NCS in de eerste conjugatiereactie een mate-van-labeling van de chelator van ongeveer 1.0-1.5 DFO verkregen / mAb. De 89 Zr radiomerking en zuivering stappen van de procedure zijn eveneens eenvoudig. Bij de concentraties die in het bovenstaande protocol,…

Discussion

Tijdens de constructie, radiolabeling en beeldvorming van ⁸⁹ Zr-DFO-gelabeld radioimmunoconjugaten algemeen een tamelijk eenvoudige procedure, is het belangrijk om een aantal belangrijke overwegingen in gedachten tijdens elke stap van het proces houden. Bijvoorbeeld, misschien wel de meest waarschijnlijke bron van zorg tijdens de vervoeging stap van de procedure is de samenvoeging van het antilichaam tijdens de conjugatiereactie. Dit probleem is meestal een product van slechte menging van de conjugatie reacti…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide