La bioconjugaison et radiosynthèse de⁸⁹ Anticorps Zr-DFO-étiquetés

Summary

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal ⁸⁹Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of ⁸⁹Zr-labeled antibodies will be described.

Abstract

L'exceptionnelle affinité, la spécificité et la sélectivité des anticorps rendent vecteurs extrêmement attrayantes pour les médicaments radiopharmaceutiques PET tumorales ciblées. En raison de leur demi-vie biologique de plusieurs jours, les anticorps doivent être étiquetés avec des radionucléides émetteurs de positrons avec relativement longues désintégration physique des demi-vies. Traditionnellement, les isotopes émettant des positrons ¹²⁴ I (t _1/2 = 4.18 d), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 h), et ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 heures) ont été utilisés pour marquer des anticorps pour l'imagerie TEP. Plus récemment, cependant, le domaine a connu une augmentation considérable de l'utilisation de la tomographie par émission de métal radioactif ⁸⁹ Zr en PET agents d'imagerie à base d'anticorps. ⁸⁹ Zr est un radio-isotope presque idéal pour l'imagerie PET avec des immunoconjugués, car il possède une moitié physique -La vie (t _1/2 = 78,4 h) qui est compatible avec la pharmacocinétique in vivo des anticorps et émet un relativement faible ènergy positrons qui produit des images haute résolution. En outre, les anticorps peuvent être carrément marqués avec ⁸⁹ Zr utilisant le chélateur de desferrioxamine sidérophores dérivée (MPO). Dans ce protocole, l'antigène de membrane de ciblage J591 d'anticorps spécifique de la prostate est utilisé comme système modèle pour illustrer (1) la bioconjugaison du chélateur bifonctionnel DFO-isothiocyanate à un anticorps, (2) la radiosynthèse et la purification d'un ⁸⁹ Zr MPO-mAb radioimmunoconjugué, et (3) in vivo l'imagerie TEP avec un ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué dans un modèle murin de cancer.

Introduction

En raison de leur sensibilité remarquable, l'affinité et la sélectivité, les anticorps ont longtemps été considérés comme des vecteurs prometteurs pour la délivrance de radio-isotopes à des cellules cancéreuses. Toutefois, leur application dans la tomographie par émission de positons (TEP) a été entravée par l'absence d'un radio-isotope émetteur de positons adapté à leur étiquetage. ^1-3 Une des considérations les plus critiques dans la conception de radioimmunoconjugués est correspondant à la décroissance physique demi- vie du radio-isotope à la pharmacocinétique in vivo de l'anticorps. Plus précisément, les anticorps ont souvent, multi-jours des demi-vies biologiques relativement longues et donc doivent être étiquetés avec des radio-isotopes avec des demi-vies physiques comparables. Pour les applications d'imagerie PET, des anticorps ont été traditionnellement marqué à ⁶⁴ Cu (t _1/2 = 12,7 h), ⁸⁶ Y (t _1/2 = 14,7 h), ou ¹²⁴ I (t _1/2 = 4.18 d). ^{4, 5} Cependant, chacun deces radio-isotopes possède des limites importantes qui entravent leur aptitude à l'imagerie clinique. Alors que radioimmunoconjugués marqués avec ⁸⁶ Y et ⁶⁴ Cu ont prouvé prometteuse dans les enquêtes précliniques, deux isotopes possèdent des demi-vies physiques qui sont trop courts pour être efficace pour l'imagerie chez l'homme. ¹²⁴ I, en revanche, a une demi-vie physique presque idéal pour l'imagerie avec des anticorps, mais il est coûteux et présente des caractéristiques de désintégration sous-optimales qui conduisent à relativement basse résolution des images cliniques. En outre, ¹²⁴ radio-immunoconjugués I-marqué peut être soumis à une déshalogénation in vivo, un procédé qui peut abaisser les rapports d'activité tumeur-à-fond. ^6,7

Le lecteur de trouver un radio-isotope émetteur de positons à supplanter ⁶⁴ Cu, ⁸⁶ Y, et ¹²⁴ I dans radioimmunoconjugués a alimenté la récente flambée des recherches sur ⁸⁹ anticorps Zr-étiquetés. ^8-12 Til raison de l'avènement de ⁸⁹ Zr est simple: l'radiométal possède des propriétés physiques et chimiques quasi-idéal et pour une utilisation dans radioimmunoconjugués PET diagnostic ^{13 89} Zr est produit par la ⁸⁹ Y (p, de n) ⁸⁹ réaction Zr sur un cyclotron en utilisant un. disponibles dans le commerce et 100% naturelle abondante ⁸⁹ cible Y ^14,15. Le métal radioactif a un rendement de 23% de positron, se désintègre avec une demi-vie de 78,4 heures, et émet des positons avec l'énergie relativement faible de 395,5 keV (figure 1). ^13,16,17 Il est important de noter que ⁸⁹ Zr émet également une grande énergie, 909 keV γ-ray avec 99% d'efficacité. Bien que cette émission ne interfère pas énergiquement avec les photons émis 511 keV, il ne nécessite examen supplémentaire en matière de transport, de manutention, et la dosimétrie. Malgré cette réserve, ces caractéristiques de désintégration définitive signifie que ⁸⁹ Zr a non seulement une plus favorable half-vie pour l'imagerie avec des anticorps ^{de 86} Y et ⁶⁴ Cu, mais peuvent aussi produire des images haute résolution de ¹²⁴ I, qui émet des positons avec des énergies plus élevées de 687 et 975 keV ainsi que d'un nombre de photons avec des énergies au sein de 100-150 keV de les photons de positons créé 511 keV. ¹³ En outre, ⁸⁹ Zr est aussi plus sûr à manipuler, moins cher à produire, et esidualise dans les tumeurs plus efficacement que son homologue de l'iode radioactif. ^18,19 Une limitation potentielle de ⁸⁹ Zr, ce est qu'il n'a pas un isotopologue thérapeutique, par exemple, ⁸⁶ Y (PET) contre ⁹⁰ Y (thérapie). Cela empêche la construction de chimiquement identiques, agents d'imagerie de substitution qui peuvent être utilisés comme éclaireurs dosimétriques pour leurs homologues thérapeutiques. Cela dit, les enquêtes suggèrent que ⁸⁹ Zr anticorps marqués ont un potentiel comme substituts d'imagerie pour ⁹⁰ Y et ¹⁷⁷ Lu-immunoconjugués marqués.^20,21

Du point de vue chimique, comme un métal du groupe IV, ⁸⁹ Zr existe en tant que cation 4 en solution aqueuse. ^L'ion Zr est fortement chargée, relativement importante (rayon ionique efficace = 0,84 Å), et peut être classé comme un cation "dur". En tant que tel, il présente une préférence pour les ligands portant jusqu'à huit disques, les donateurs anioniques d'oxygène. Facilement le chélateur le plus couramment utilisé dans ⁸⁹ radioimmunoconjugués Zr-étiquetés est desferrioxamine (MPO), un sidérophore dérivés, chélateur acyclique portant trois groupes hydroxamate. Le ligand coordonne de manière stable le cation Zr ⁴⁺ rapidement et proprement à la température ambiante à des niveaux de pH biologiquement pertinentes, et le complexe Zr-MPO résultant reste stable au cours de plusieurs jours dans une solution saline, le sérum sanguin, et le sang total. ²² études computationnelles suggèrent fortement que le MPO forme un complexe hexacoordiné de Zr ⁴⁺ dans laquelle le centre métallique est coordiné à trois neutral et trois donneurs d'oxygène anioniques du ligand ainsi que les deux ligands exogènes d'eau (Figure 2). ^23,24 Le comportement in vivo des radioimmunoconjugués employant la conjugaison échafaudage ⁸⁹ Zr-MPO a généralement été excellente. Cependant, dans certains cas, l'imagerie et les études de biodistribution aiguës ont révélé des niveaux d'activité élevés dans les os des souris injectées avec ⁸⁹ des anticorps Zr-marquées, des données qui suggèrent que la ostéophile ⁸⁹ Zr ⁴⁺ cation est libéré de l'agent chélatant in vivo et ensuite minéralise dans l'os. ²⁵ Récemment, un certain nombre d'enquêtes sur le développement de nouveaux ⁸⁹ Zr ⁴⁺ chélateurs ligands particulièrement avec huit donneurs d'oxygène ont été publiés dans la littérature. ^24,26,27 Néanmoins, à l'heure actuelle, le MPO est le chélateur la plus largement utilisée dans ⁸⁹ radioimmunoconjugués Zr marqué par une large marge. Une grande variété destratégies de bioconjugaison ont été utilisées pour attacher le MPO à des anticorps, y compris bioorthogonal chimie clic, la réaction d'un thiol réactif MPO construit avec cysteines dans l'anticorps, et la réaction de l'ester activé portant MPO construit avec lysines dans l'anticorps. ^{4,28- 30} Facilement la stratégie la plus courante, cependant, a été l'utilisation d'un dérivé de l'isothiocyanate portante du MPO, le MPO-NCS (Figure 2). ²² Ce chélateur bifonctionnel disponible dans le commerce robuste et fiable des formes stables, des liaisons covalentes de thiourée avec les lysines de la anticorps (figure 3).

Au cours des dernières années, une grande variété de ⁸⁹ radioimmunoconjugués Zr-DFO-marqués ont été rapportés dans la littérature. Études précliniques ont été particulièrement abondante, avec des anticorps qui vont de la plus connue cetuximab, le bevacizumab et le trastuzumab à des anticorps plus ésotériques comme le CD105 ciblage TRC105 et fPSA ciblage 5A10. ^30-36 Plus récemment, un petit nombre d'essais cliniques de phase précoce en utilisant des anticorps ⁸⁹ Zr-DFO-marquées sont apparues dans la littérature. Essais spécifiquement, les groupes aux Pays-Bas ont publié employant ⁸⁹ Zr-DFO-CMAb U36, ⁸⁹ Zr-DFO-ibritumomab tiuxétan, et ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab. ^21,32,37 En outre, une série d'autres essais cliniques avec ⁸⁹ radioimmunoconjugués Zr-étiquetés sont actuellement en cours, y compris les enquêtes ici au Memorial Sloan Kettering Cancer Center à l'aide de la LMFP ciblage ⁸⁹ Zr-DFO-J591 pour l'imagerie du cancer de la prostate et le ⁸⁹ Zr-DFO-trastuzumab HER2-ciblage pour l'imagerie du cancer du sein. ^{23, 30} En outre, alors que les anticorps radiomarqués restent les ⁸⁹ produits radiopharmaceutiques marqués Zr plus courantes, le métal radioactif a également été utilisée de plus en plus avec d'autres vecteurs, y compris des peptides, des protéines, et des nanomatériaux. ^38-43 </sup>

La modularité de ce ⁸⁹ Zr-MPO méthodologie d'étiquetage est un atout formidable. Le répertoire d'anticorps de ciblage biomarqueurs est en pleine expansion, et de l'intérêt dans l'exécution de l'imagerie PET vivo en utilisant ces constructions est de plus en plus rapidement. En conséquence, nous croyons que le développement de pratiques et de protocoles normalisés plus pourrait bénéficier le domaine. Un excellent protocole expérimental écrite pour le MPO-NCS conjugaison et ⁸⁹ Zr radiomarquage a déjà été publié par Vosjan, et al. ²² Nous pensons que la démonstration visuelle fournie par ce travail pourrait en outre aider les enquêteurs à ces nouvelles techniques. Dans le protocole à la main, l'antigène de membrane de ciblage J591 d'anticorps spécifique de la prostate est utilisé comme système modèle pour illustrer (1) la bioconjugaison du chélateur bifonctionnel DFO-isothiocyanate à un anticorps, (2) la radiosynthèse et la purification de la ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué,et (3) in vivo l'imagerie TEP avec un ⁸⁹ Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugué dans un modèle murin de cancer. ^23,44,45

Protocol

Toutes les expériences in vivo d'animaux décrits ont été réalisés selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (IACUC). 1. Conjugaison du MPO-NCS à J591 Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 ml, préparer une solution à 2-5 mg / ml de J591 dans 1 ml d'une solution saline 1x tamponnée au phosphate (pH 7,4) ou du tampon HEPES 0,…

Representative Results

La première étape de ce protocole la conjugaison du MPO-NCS à l'anticorps est généralement assez robuste et fiable. Généralement, le, immunoconjugué chélateur modifié purifié peut être obtenu à un rendement> 90%, et en utilisant trois équivalents molaires de DFO-NCS dans la réaction de conjugaison initiale donnera un degré de marquage de l'agent chélatant d'environ 1,0 à 1,5 MPO / mAb. Les 89 Zr radiomarquage et de purification étapes de la procédure sont également simple. …

Discussion

Alors que la construction, radioimmunoconjugués radiomarquage, et l'imagerie de ⁸⁹ Zr-DFO-étiqueté est généralement une procédure assez simple, il est important de garder quelques considérations clés à l'esprit au cours de chaque étape du processus. Par exemple, peut-être la cause la plus probable de préoccupation lors de l'étape de conjugaison de la procédure est l'agrégation de l'anticorps au cours de la réaction de conjugaison. Ce problème est le plus souvent un produit…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
p-SCN-Bn-DFO	Macrocyclics	B-705	Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate	Various, including Perkin-Elmer	–	Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01	Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC805024	Store at room temperature
Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper	Agilent Technologies	SGI0001	Cut into strips 0.5 cm wide