Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.
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Artigo de método
A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mosquitos vetores infligir sofrimento mais humano do que qualquer outro organismo - e matar mais de um milhão de pessoas a cada ano. Os projetos mosquito genoma facilitou a pesquisa em novas facetas da biologia do mosquito, incluindo estudos genéticos funcionais no principal vetor Africano malária Anopheles gambiae eo dengue e amarelo vetor da febre Aedes aegypti. ARN de interferência (RNAi-) silenciamento de genes mediado foi usado para genes alvo de interesse em ambas as espécies de mosquito vector doença. Aqui, descrevemos um procedimento para a preparação de quitosana / interferindo nanopartículas de RNA que são combinados com alimentos e ingeridos pelas larvas. Este, de alto rendimento tecnicamente simples, relativamente barato e metodologia, que é compatível com o RNA de cadeia dupla de comprimento (dsRNA) ou pequenos ARN interferentes (siRNA) moléculas, tem sido utilizado para o knockdown bem sucedida de um número de diferentes genes em A. gambiae e A. aegyptilarvas. Após as mamadas larvais, knockdown, o que é verificado através de qRT-PCR ou hibridação in situ, podem persistir pelo menos até a fase de pupa tarde. Esta metodologia pode ser aplicada a uma grande variedade de espécies de mosquitos e outros insectos, incluindo pragas agrícolas, bem como outros organismos não-modelo. Para além da sua utilidade no laboratório de investigação, no futuro, o quitosano, um polímero barato, não-tóxicos e biodegradáveis, podem ser potencialmente utilizados no campo.
Introdução
Mosquitos sanguíneos que alimentam vetor dos gêneros de anofelinos e aedine transmitir agentes causadores de doenças responsáveis por vários dos piores flagelos da humanidade. Estima-se que 3,4 bilhões de pessoas estão em risco de contrair a malária, que é responsável por mais de meio milhão de mortes por ano em todo o mundo. Resultados da malária de infecção por Plasmodium sp., Que parasita, que são transmitidos às pessoas através da picada de mosquitos infectados do gênero Anopheles, incluindo o principal vector Africano Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014)....
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Protocolo
1. Mosquito Espécies e Empinar
- Manter A. gambiae G3 e A. estirpes aegypti Liverpool IB12 (utilizadas nos estudos representativos abaixo) ou outras estirpes de interesse de acordo com a prática padrão do laboratório ou como descrito anteriormente 23,24.
2. dsRNA e siRNA Design e Produção
- Iniciadores de design para a construção de modelos de ARNcd longos específicos para o gene de interesse. Use a ferramenta E-RNAi 25. Produzir ARNcd de acordo com o método de escolha ou como previamente descrito 19.
- Para um controlo negativo, sintetizar dsRNA
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Resultados
A. gambiae:
Nanopartículas de quitosano / dsRNA são formados devido à interacção electrostática entre os grupos amino de quitosano e os grupos fosfato de ARNdc. A eficiência de incorporação em nanopartículas ARNcd é geralmente superior a 90% tal como medido pela depleção de ARNcd a partir da solução. Atomic imagens de microscopia de força mostra que as médias de tamanhos de partículas de quitosano-dsRNA de 140 nm de diâmetro, que varia 100-200 nm (Figu.......
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Discussão
O quitosano / interferindo metodologia de nanopartículas ARN aqui descrita tem sido usada para identificar eficazmente genes durante o desenvolvimento das larvas em A. gambiae (Figuras 2, 3) e A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, Tabelas 1, 2). Nanopartículas de quitosano podem ser preparadas com ou longo siRNA dsRNA ou, ambos os quais têm sido utilizados com sucesso em mosquitos como evidenciado pelos resultados representativos aqui descritos. Síntese de dsRNA é menos caro do.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O financiamento da Estação Experimental Agrícola do Kansas e do Centro de Genômica de Artrópodes do Estado K para KYZ apoiou o desenvolvimento original do silenciamento de genes mediado por quitosana / dsRNA em A. gambiae19. O trabalho de A. gambiae descrito aqui foi apoiado em parte pelo R01-AI095842 do NIH / NIAID para KM. O desenvolvimento do silenciamento de genes mediado por quitosana / siRNA em A. aegypti20,21 foi apoiado pelo Prêmio NIH / NIAID R01-AI081795 para MDS. O conteúdo deste estudo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipetador de 0,02 ml | Rainin | PR20 | para ressuspensão de RNA interferente |
| Pipetador de 0,2 ml Rainin | PR200 | para ressuspensão de RNA interferente e preparação de RNA interferente/nanopartículas | |
| Tubo graduado de 0,5 ml | Fischer Scientific | 05-408-120 | para aliquotação de RNA interferente ressuspenso |
| 1 ml pipeteiro | Rainin | PR1000 | para ressuspensão de RNA interferente e preparação de RNA interferente/nanopartículas |
| graduado de 1,5 ml | Fischer Scientific | 05-408-046 | para preparação de RNA interferente / nanopartículas |
| 1M Acetato de Sódio, pH 4,5 | TEKnova | S0299 | para preparar tampão de acetato de sódio |
| Ácido Acético, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grau | BDH | VWR BDH3092-500MLP | para preparar tampão de acetato de sódio |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | para revestir RNA/nanopartículas interferentes preparadas |
| Centrífuga | Eppendorf AG | 5415D | para granular RNA/nanopartículas interferentes |
| Quitosana, de cascas de camarão | Sigma-Aldrich | C3646-25G | para combinar com RNA interferente para preparação de RNA/nanopartículas |
| interferentes Levedura Seca | Universal Food Corp | NA | para preparar alimentos larvais de mosquitos com RNA/ nanopartículas |
| E-RNAi ferramenta | Centro Alemão de Pesquisa do Câncer | NA | para design de dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| ração para peixinho dourado | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | para preparar comida larval de mosquito com RNA/nanopartículas interferentes |
| Banho-maria aquecido | Thermo Scientific | 51221048 | para aquecer o RNA/nanopartículas interferentes a 55oC |
| Gelo | não aplicável | não aplicável | para descongelamento de RNA interferente e preparação de RNA/nanopartículas |
| [header] | |||
| Balde de gelo | Fisher Scientific | 02-591-44 | para armazenamento de gelo usado durante o procedimento |
| pó de fígado | MP Biomedicals LLC. | 900396 | alimentar larvas de mosquito após o tratamento de RNA/nanopartículas interferentes |
| Forno de microondas | Uma variedade de fornecedores | não aplicável | para preparar solução de agarose a 2% |
| de petride (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | câmara de alimentação de RNA/nanopartículas interferentes para larvas |
| Medidor de pH | Mettler Toledo | S220 | para preparação de tampões |
| Lâmina de barbear | Fischer Scientific | 12-640 | para dividir o pellet de RNA/nanopartícula interferente para alimentação de |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | para preparação de siRNA/nanopartículas |
| Sulfato de sódio, anidro (Na2SO4) | BDH/distribuído pela VWR | VWR BDH0302-500G | para preparar solução de sulfato de sódio de 50 mM na qual o RNA interferente será |
| Termómetro | VWR | 61066-046 | para medir a temperatura do banho-maria |
| Palitos de dente | VWR | 470146-908 | para mexer durante a preparação de alimentos de RNA/nanopartículas interferentes e cortar pellets de gel |
| Congelador ultrabaixo | Uma variedade de fornecedores | não aplicável | para armazenamento de alíquotas de RNA interferentes e RNA/nanopartículas interferentes a -80oC |
| Misturador de vórtice | Fischer Scientific | 02-216-108 | para preparação de quitosana/RNA interferente |
| Papel de peso | Fischer Scientific | NC9798735 | para dividir o pellet de RNA/nanopartícula interferente para alimentação |
Referências
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organizat....
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Reimpressões e permissões
