Mosaïque poisson zèbre transgénèse pour l'analyse génomique fonctionnelle des gènes candidats de coopération dans la tumeur pathogenèse

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Les cancers sont des maladies évolutives marquées par l'accumulation de mutations pathologiques, des suppressions et des gains de chromosomes au cours du temps. Ces anomalies génétiques peuvent influer sur des processus cellulaires multiples allant du cycle cellulaire, la mort cellulaire, le métabolisme énergétique et l'assemblage du cytosquelette d'insister sur les réponses telles que l'hypoxie. Par conséquent, la tumorigenèse reflète les actions collectives de multiples aberrations génétiques à travers un éventail de processus biologiques. Des efforts récents d'intégration génomiques de recherche, y compris l'ensemble du séquençage du génome, le séquençage de l'exome, le séquençage ciblé, le séquençage profond et études d'association pangénomique, ont identifié un nombre croissant d'altérations génétiques dans pratiquement tous les nouveaux types de tumeurs ^1-4. Dans de nombreux cas, les lésions génétiques se produisent ensemble d'une manière non aléatoire ^8/5, ce qui suggère leur coopération dans la pathogenèse de la maladie. Disséquer les rôles oncogéniques de la vaste gamme de gènes exprimés de façon aberrante résultant felon ces lésions génomiques est nécessaire de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de comprendre les réponses des cellules tumorales à ces agents, mais cela se est avéré être une tâche ardue, nécessitant des systèmes de modèles animaux très robustes pour la conduite de l'analyse génomique fonctionnelle à haut débit dans vivo.

Bien que les mammifères, notamment les rongeurs, des modèles favorisées en biologie du cancer, du poisson-zèbre est commencé à attirer une attention considérable. Le téléostéens poisson zèbre (Dario rerio) a été utilisé comme un organisme modèle pour l'étude de développement depuis les années 1960 et a été appliquée à l'étude de la pathogenèse de la tumeur première fois en 1982 ^9-11. Facilité de maintenance, de petite taille du corps, et une fécondité élevée rendre le poisson zèbre, un modèle robuste pour les grands écrans génétiques à terme pour identifier les mutations qui confèrent des phénotypes anormaux et pathologiques ^10. La transparence optique des embryons de poisson zèbre est un autre élément clé de soutien plus large utilisation de ce modèle de cancer,il permet l'imagerie in vivo être menées pour localiser le développement de la tumeur en temps réel ^9, une application qui est relativement difficile chez les rongeurs ^12. Génomique comparative récente analyse du génome de référence poisson zèbre (Zv9) a révélé 26 206 gènes codant pour des protéines, avec 71% ayant orthologues humains, dont 82% sont corrélés avec des gènes associés à la maladie de la ligne mendélienne héritage à Man base de données (OMIM) ^{13, 14.} Par conséquent, le poisson-zèbre a été utilisé pour modéliser différents types de cancers humains, y compris le neuroblastome ^8, des cellules T de la leucémie lymphoblastique aiguë (LAL-T) ^{15,16, 17,18} mélanome, le sarcome d'Ewing ^{19, 20,21} rhabdomyosarcome, le carcinome du pancréas ^22, carcinome hépatocellulaire et ²³ tumeurs malignes ^24,25 myéloïde, et a été choisi comme un modèle de cancer pour la xénotransplantation étudie ^11,26.

Un transgénique stableapproche chez le poisson zèbre est couramment utilisé pour étudier l'effet de gain de fonction des gènes dans le développement normal ou maladie pathogenèse ^27,28. Pour développer un tel modèle (figure 1A), on injecte un produit d'assemblage d'ADN contenant le gène d'intérêt dirigé par un promoteur spécifique d'un tissu dans une des cellules d'embryons de type sauvage. Trois à quatre mois après l'injection, lorsque les embryons injectés atteignent la maturité sexuelle, ils sont par croisement avec des poissons sauvages pour dépister ceux qui décrivent l'intégration de la construction d'ADN dans leur lignée germinale, qui les licences que les poissons fondateur. De nombreux facteurs, tels que le nombre de copies et le site d'intégration du transgène, affectent l'expression du transgène dans des lignées transgéniques stables. Ainsi, afin de développer un modèle de tumeur transgénique, plusieurs lignées transgéniques stables surexprimant un seul oncogène doivent être générés premier et projeté de la ligne exprimant le transgène à un niveau qui pourrait conduire à l'induction de tumeurs. Cependant, si la surexpression d'un candidat oncogene est toxique pour les cellules germinales, il est difficile de générer une lignée transgénique stable directement en surexprimant le transgène ^29. Par conséquent, cette approche peut prendre beaucoup de temps, avec un risque élevé d'échec pour générer un modèle de cancer approprié.

Ici, nous montrons une stratégie de rechange sur la base de la transgenèse mosaïque transitoire (figure 1B) qui fournit des avantages uniques par rapport transgénèse classique stable pour l'étude génomique fonctionnelle in vivo. Dans cette approche, un ou plusieurs constructions transgéniques sont injectés dans le stade d'une cellule d'transgéniques ou de type sauvage embryons. Les constructions d'ADN injectés contenant des transgènes sont alors mosaically et aléatoirement intégrés dans le poisson injecté primaire, résultant en génotypes mixtes au sein des populations de cellules multiples dans chaque poisson ^30. De plus, la co-injection d'ADN dans des embryons multiples construit une des cellules conduit à la co-intégration dans la même cellule dans des sites aléatoires, ce qui permet à une traCE les cellules avec une expression de transgènes et d'explorer les interactions des gènes différents au cours pathogenèse de la maladie chez les animaux mosaïque ^31. Comme preuve de principe, nous transitoirement surexprimé ALK par mutation activée (F1174L) avec le gène rapporteur mCherry dans le système nerveux sympathique périphérique (SNPS) sous le contrôle du hydroxylase dopamine bêta (d βh) de promoteur en poissons sauvages et poissons transgéniques surexprimant MYCN. ALK, qui code pour un récepteur tyrosine kinase, est le gène le plus fréquemment muté dans le neuroblastome à haut risque ^5-7,32,33. ALK (F1174L), comme l'un des mutations activatrices somatiques les plus fréquentes et les plus puissants, est sur-représentée dans MYCN- amplifié patients de neuroblastome à haut risque et en synergie avec MYCN surexpression d'accélérer neuroblastome tumorigenèse chez les souris transgéniques stables et des modèles de poisson zèbre transgénique ^8,34,35. Par mosaïquela surexpression transitoire de ALK (F1174L) avec mCherry dans le poisson transgénique MYCN, on a récapitulé l'accélération de l'apparition de la tumeur observée dans le poisson transgénique stable surexprimant la fois ALK (F1174L) et MYCN, ce qui suggère que la stratégie de transgénèse mosaïque peut être utilisé pour rapidement et efficacement évaluer les contributions respectives de plusieurs oncogènes dans l'initiation de la tumeur in vivo.

Protocol

NOTE: Toutes les études de poisson zèbre et l'entretien des animaux ont été effectuées en accord avec la Mayo Clinic Institut IACUC approuvé le protocole # A41213. 1. Constructions d'ADN pour la transgenèse Amplifier un 5,2 kb dopamine beta hydroxylase (d βh) région promotrice 8 en utilisant le clone CH211-270H11 BAC (de BACPAC centre de ressources (BPRC)) comme une matrice d'ADN. Utilisation d'un système approprié de PCR pour l'a…

Representative Results

Afin de déterminer si la surexpression de F1174L ALK par mutation activée ou de type sauvage ALK pourrait collaborer avec MYCN dans le neuroblastome induction, nous avons surexprimé soit ALK humaine activée ou de type sauvage ALK humaine sous le contrôle du promoteur d de βh dans le SNPS des poissons transgéniques surexprimant MYCN. Chacune des constructions suivantes, DßH – ALKF1174L ou DßH – ALKWT, ont été co-…

Discussion

Dans cette étude représentative, nous avons utilisé co-injection transitoire et co-expression de ALK activé avec le gène rapporteur mCherry dans MYCN dites-vous les poissons transgéniques à montrer que ces gènes coopèrent pour accélérer nettement le début de neuroblastome, conformément à notre constatation précédente composé stable coexprimant de poissons transgéniques deux ALK et MYCN ⁸ activé. Cette approche transgénique mosaïque possède plu…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY