Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Kanserler zamanla patolojik mutasyonlar, silmeler ve kromozom kazançları birikimi ile işaretlenmiş ilerici hastalıklardır. Bu genetik anormallikler, hipoksi gibi yanıtları stres hücre iskeletinin hücre döngüsü, hücre ölümü, enerji metabolizmasında ve montaj kadar çok sayıda hücresel süreçleri etkileyebilir. Bu nedenle, tümörigenezin biyolojik süreçlerin bir yelpazede çok sayıda genetik bozuklukların kolektif eylemleri yansıtır. Tüm genom dizileme, exome sıralanması, hedeflenen sıralama, derin sıralama ve genom dernek çalışmaları da dahil olmak üzere son bütünleştirici genomik araştırma çabaları, tümörlerin ^1-4 esasen her türlü yeni genetik değişikliklerin giderek artan sayıda belirledik. Birçok durumda, genetik lezyonlar hastalığın patogenezinde işbirliğini düşündüren, bir rastgele olmayan bir şekilde ^5-8 birlikte görülür. F Elde edilen anormal ifade edilen genlerin büyük bir dizi onkojenik rolleri KesmeBu genomik lezyonları rom, yeni tedavi stratejileri hazırlamak ve bu ajanların tümör hücrelerinin tepkilerini anlamak için gerekli, ancak bu yüksek verimli fonksiyonel genomik analiz yürütülmesinde çok sağlam hayvan modeli sistemleri gerektiren, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır vivo.

Memeliler, özellikle kemirgenler, kanser biyolojisinde tercih modeller olmasına rağmen, Zebra balığı büyük ilgi çekmek için başlamıştır. Teleost zebra balığı (Dario rerio) 1960 yılından bu yana gelişim incelemesi için bir model organizma olarak kullanılmaktadır ve birinci 1982 ^9-11 tümör patojenez çalışma uygulanmıştır. Bakım, küçük vücut büyüklüğü ve yüksek doğurganlık kolaylığı Zebra balığı anormal ve patolojik fenotipleri ¹⁰ görüşmek mutasyonları tespit etmek büyük ölçekli ileri genetik ekranlar için sağlam bir model olun. Zebra balığı embriyolarının optik şeffaflık gibi, bu kanser modelinin daha geniş kullanımını destekleyen bir başka önemli özelliğiBu, gerçek zamanlı ^9, kemirgen ¹² nispeten zor bir uygulama, tümör gelişmesini bulmak için yapılacak in vivo görüntüleme sağlar. Zebra balığı referans genom (Zv9) son karşılaştırmalı genomik ^analiz,% 71% 82 Man (OMIM) veritabanında ¹³ Online Mendel Kalıtım hastalıkla ilişkili genleri ile ilişkili olan insan ortologlara, sahip, 26.206 protein kodlama genleri ortaya ^14. Sonuç olarak, Zebra balığı nöroblastom ⁸ dahil olmak üzere insan kanserlerinin farklı tipleri, modellemek için kullanılır olmuştur, T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) ^15,16, melanom ^17,18, Ewing sarkomu ^19, rabdomiyosarkoma ^20,21, pankreas karsinomu ^22, hepatoselüler karsinom ²³ ve miyeloid ^24,25 malignitesinin ve Ksenonakilden bir kanser modeli ^11,26 çalışmalar olarak seçilmiştir.

Stabil bir transgenikZebra balığı yaklaşım yaygın kazanç fonksiyon-normal gelişimi veya hastalık patogenezinde ^27,28 genlerin etkisini incelemek için kullanılır. Bu tip bir model (Şekil 1A) geliştirmek için, bir tek hücreli vahşi tip embriyolara bir doku spesifik promotör tarafından sürülen ilgili geni içeren bir DNA yapısı enjekte eder. Enjekte embriyolar cinsel olgunluğa ulaştığında Üç dört ay enjeksiyondan sonra, onlar kurucu balık olarak lisansları onların germline içinde inşa DNA entegrasyonu gösteren olanlar için ekrana vahşi tip balık çaprazlanırlar. Bu tür kopya sayısına ve transgen entegrasyonu alanı olarak bir çok faktör, kararlı transgenik hatlarda transjenin ekspresyonunu etkilemektedir. Bu nedenle, transgenik bir tümör modeli geliştirmek için, tek bir onkojenini aşırı ifade çok kararlı transgenik çizgiler, ilk oluşturulan ve tümör indüksiyonu yol açacak bir seviyede transgen ifade hattı için taranması gerekecektir. Fakat, eğer bir aday o aşırı ekspresyonuncogene germ hücreleri için toksik olan, doğrudan transgen ²⁹ aşırı eksprese eden stabil bir transgenik çizgiden üretmek zordur. Dolayısıyla, bu yaklaşım uygun bir kanser modeli oluşturmak için başarısızlık riski yüksek olan, zaman alıcı olabilir.

Burada, in vivo fonksiyonel genomik çalışma için geleneksel sabit transgenesis benzersiz avantajlar sağlamaktadır mozaik geçici transgenezi (Şekil 1B) dayalı bir alternatif strateji göstermektedir. Bu yaklaşımda, bir veya daha fazla transgen yapıları transgenik ya da vahşi türdeki embriyo tek hücreli aşamada enjekte edilir. transgenleri ihtiva eden enjekte DNA yapıları, tek tek balık ^30, çok hücreli bir popülasyon içindeki karıştırılmış genotipler ile sonuçlanan, daha sonra mosaically rastgele primer enjekte balık entegredir. Ayrıca, birden fazla DNA ko-enjeksiyon tek hücreli embriyolar yapıları birlikte entegrasyon rasgele sitelerde aynı hücreye, Tra için izin açarTransjenlerin hücreleri ce ve mozaik hayvanlarda ³¹ hastalık patogenezi sırasında farklı genlerin etkileşimi keşfetmek. Prensip kanıtı olarak, geçici olarak doğal tipte balık ve MYCN ifade eden transjenik balık dopamin beta hidroksilaz (d βh) promoteri kontrolü altında, periferal simpatetik sinir sistemi (PSNS) 'de MCherry raportör geni ile mutationally aktive ALK (F1174L) aşın. bir reseptör tirosin kinazını kodlamaktadır ALK, yüksek riskli nöroblastom ^5-7,32,33 de en sık mutasyona genidir. ALK en yaygın ve potansiyel somatik aktive mutasyonlar olarak (F1174L), temsil edilen aşırı bir MYCN- yüksek riskli hastalar nöroblastom büyütülmüş ve stabil bir transgenik fareler ve transjenik zebra balığı model ^8,34,35 hem de nöroblastom tümörogenez hızlandırmak için MYCN aşırı ekspresyonu ile sinerjize etmektedir. Mozaik tarafındanMYCN transgenik balık mCherry ile ALK (F1174L) geçici olarak aşın, mozaik transgenezi stratejisi için hızlı ve etkili bir şekilde kullanılabileceğini düşündüren, ALK (F1174L) ve MYCN hem aşırı ifade eden stabil transgenik balık gözlemlenen tümör başlangıç ​​ivme değinmeyecek in vivo tümör başlatılması birden onkojenlerin göreceli katkıları değerlendirmek.

Protocol

Not: tüm zebra balığı çalışmalar ve hayvan bakımı Mayo Kliniği Enstitüsü, IACUC onaylı protokol # A41213 ile uygun olarak yapılmıştır. Transgenesis 1. DNA konstruktları Bir DNA şablonu olarak (BACPAC kaynakları merkezine (BPRC) 'den) CH211-270H11 BAC klonu kullanılarak bir 5.2 kb dopamin beta hidroksilaz (d βh) promotör bölgesini 8 yükseltin. 2 dakika için 94 ° C, (94 ° C, 15 saniye, 50 ° C, 10 döngü 30 saniye 68 °: Uzun DNA …

Representative Results

Mutationally aktif ALK F1174L veya vahşi tip ALK aşın nöroblastom indüklenmesinde MYCN ile işbirliği olup olmadığının araştırılması için, MYCN ifade eden transjenik balık PSNS d βh promoterinin kontrolü altında aktive edilmiş insan ALK ya da vahşi-tipli insan ALK ya aşın. ALKF1174L veya dβh – – aşağıdaki yapıları, dβh herhangi biri ALKWT, dβh ile birlikte enjekte edildi – mCherry te…

Discussion

Bu temsili çalışmada, bu genler, belirgin bir şekilde bileşik kararlı transgenik balık coexpressing bizim önceki bulgusuyla tutarlıdır nöroblastom başlamasını hızlandırmak için işbirliği göstermek için transgenik balık -expressing MYCN içinde MCherry raportör geni ile geçici birlikte enjeksiyonu ve aktif ALK yakımının birlikte kullanılır Her iki ALK ve MYCN ⁸ aktif. Bu yöntem ile mozaik transgenik bir yaklaşım geleneksel bir yöntem…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY