Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Tanto transcripcional y post-transcripcional regulación tienen un profundo impacto en los genes de expresión. Sin embargo, los ensayos de cribado basados en células comúnmente adoptadas se centran en la regulación transcripcional, siendo destinado esencialmente a la identificación de moléculas promotoras de metas. Como resultado, los mecanismos post-transcripcionales se descubren en gran medida por el desarrollo de fármacos dirigidos expresión génica. Aquí se describe un ensayo basado en células destinado a investigar el papel de la 'región no traducida (3' UTR del 3) en la modulación de la suerte de su ARNm, y en la identificación de compuestos capaces de modificarla. El ensayo se basa en el uso de un constructo informador de luciferasa que contiene el 3 'UTR de un gen de interés integrado de manera estable en una línea celular relevante para la enfermedad. El protocolo se divide en dos partes, con el foco inicial en el cribado primario dirigido a la identificación de moléculas que afectan a la actividad de luciferasa después de 24 h de tratamiento. La segunda parte del protocolodescribe el contador de detección necesario discriminar compuestos que modulan la actividad de la luciferasa específicamente a través de la UTR 3 '. Además del protocolo detallado y resultados representativos, proporcionamos consideraciones importantes sobre el desarrollo del ensayo y la validación de la exitosa (s) en la diana endógeno. El ensayo de gen indicador basado en células descrito permitirá a los científicos identificar moléculas que modulan los niveles de proteína a través de post-transcripcional mecanismos que dependen de un 'UTR 3.
Introduction
Durante un largo período de regulación transcripcional de la expresión génica se cree que desempeñan un importante papel exclusivo, si no en el control de la producción de proteínas. La acumulación de pruebas, sin embargo, indica que la regulación post-transcripcional contribuye tanto como, si no más, que la regulación transcripcional para determinar la abundancia de proteínas celulares 1,2. El control post-transcripcional de la expresión génica es mucho más compleja y elaborada que estaba en primer pensamiento. De hecho, todas las diversas etapas de control post-transcripcional han surgido para ser regulada, incluyendo el procesamiento de ARNm, la localización, la rotación, la traducción 3, así como la metilación reversible de ARN recientemente descrita 4. Desde un número de procesos de regulación post-transcripcional potencialmente afectado, el ensayo descrito a continuación se centra en aquellos que involucran 'región no traducida (3' UTR del mRNA 3). 3 'UTR afecta ampliamente ARNm destino principalmente a través de la interacción específica de pr ARN vinculanteoteins y ARNs no codificantes a sus secuencias reguladoras y / o estructuras secundarias 5. Por lo tanto, las pequeñas moléculas que alteran estas interacciones o interfieren con las vías de transducción de señales de aguas arriba se desplazará el equilibrio que regula la abundancia de proteínas. Este enfoque terapéutico es de particular importancia para las patologías humanas para las que existan pruebas que muestran que los genes relevantes de la enfermedad son sometidos a la regulación post-transcripcional, lo que representa, pues, un objetivo potencial para la intervención farmacológica. Por lo tanto, los sistemas que permiten la detección de moduladores de los niveles de mRNA 'a través de la interferencia con los mecanismos de control post-transcripcional en un formato de alto rendimiento pueden llegar a ser herramientas valiosas en la identificación de nuevos tratamientos potenciales.
El ensayo de gen indicador basado en células descrito permite la identificación de compuestos capaces de modular mRNA destino a través de mecanismos dependientes de su extremo 3 'UTR. Consiste en varias c directorOMPONENTES (Figura 1) y requiere algunos pasos preliminares para validar la viabilidad del ensayo. En primer lugar, el constructo indicador está diseñado para incluir la UTR 3 'de un gen de interés. La 3 'UTR se fusiona con el extremo de un gen informador tal como luciferasa de luciérnaga (Figura 1). Cualquier cambio en los mecanismos de control post-transcripcional ejercidas a través de la insertado 3 'UTR se alterar la estabilidad y / o eficacia de traducción de esta transcripción quimérico, resultando en niveles variados de luciferasa. Por lo tanto, los cambios en la actividad de luciferasa sirven como medida indirecta de la regulación post-transcripcional afectada del gen de interés. El segundo componente del sistema es un constructo indicador de control, un plásmido de expresión idéntica que expresa el mismo gen informador, pero que no contiene ningún 3 'UTR. Los dos plásmidos informadores pueden ser diseñados en el laboratorio usando protocolos de biología molecular convencionales o adquirirse de fuentes comerciales.
La selección de una línea celular apropiada es fundamental para la construcción de ensayo. ¿Qué línea celular es el modelo óptimo depende de numerosos factores que van desde los requisitos clínicos como semejanza máxima a la patología a cuestiones prácticas, como acaba de características disponibilidad, transfectability y crecimiento. Es importante destacar que, antes de proceder uno debe asegurarse de que la fusión de 3 'UTR del gen reportero tiene un efecto esperado en el nivel de la transcripción quimérico. La ausencia de diferencia significativa en la señal de luciferasa a partir de la 3 'UTR de soporte y control reportero construcciones transfectadas transitoriamente en las células seleccionadas indicaría que el 3' UTR no es funcional en este modelo celular, lo que provocó para la búsqueda de los alternativos. Para el formato de alto rendimiento, los 3 'UTR-cojinete y el control de luciferasa reportero construcciones deben integrarse de manera estable en la línea celular seleccionada. El uso de un integrado de forma estable sobre transfectadas transitoriamentelínea celular es preferible por varias razones. Esto ampliará la elección de un modelo celular incluyendo líneas de células difíciles de transfectar, disminuir la variabilidad en los datos derivados de las fluctuaciones en la eficiencia de la transfección, disminuir los costes. Por otra parte, sobre las células de transfección transitoria son muy a menudo sobrecargados con un plásmido de ADN que conduce a la saturación del sistema. En estas configuraciones un aumento adicional en la expresión reportero podría ser un reto, lo que resulta en una disminución de la sensibilidad hacia compuestos potenciales upregulating.
Finalmente, cuando todos los componentes del ensayo se configuran, es fundamental antes de pasar al formato de alto rendimiento para determinar la viabilidad de la prueba, es decir, si la actividad de la luciferasa puede ser de hecho arriba y hacia abajo reguladas específicamente a través de la insertado 3 ' UTR. Los mejores controles serían pequeñas moléculas informado de modular la estabilidad o la traducibilidad del ARNm a través de UTR 3 'de interés. Si tener estos esno es posible, se aceptan los controles de sustitución que imitan el efecto deseado. Estos podrían ser miRNAs o proteínas de unión al ARN conocidos para ejercer sus efectos mediante la unión a la 3 'UTR de interés. Evaluación de dichos controles antes de la proyección primaria no sólo indica la funcionalidad del ensayo desarrollado, sino que también permite para la estimación de su rango dinámico, la sensibilidad y el rendimiento en el formato de alto rendimiento.
Utilizando el protocolo descrito que exhibió una biblioteca 2000-compuesto 6. El neuroblastoma, el tumor sólido extracraneal más frecuente de la infancia, se utilizó como modelo biológico y el 3 'UTR del oncogén MYCN, cuya amplificación predice fuertemente resultado adverso de neuroblastoma, como un gen diana 7. La figura 2 describe el diseño experimental. La proyección se dividió en tres carreras con el tamaño del lote de 27 placas proyectadas en una carrera. El lote de 27 placas de biblioteca incluye Spectrum CollectionPlacas n.1-n.8 + n.25 (primera pista), n.9-n.16 + n.25 (segundo plazo) y n.16-n.24 + n.25 (tercera pista), cada placa proyectó por triplicado. Por lo tanto, una placa de biblioteca (n.25) se ensayó en las tres carreras que hacen posible la comparación inter-run. El protocolo a continuación describe una sola corrida de 9 placas de bibliotecas analizadas por triplicado.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
Referências
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