High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Zowel transcriptionele en post-transcriptionele regulatie hebben een grote invloed op de genen expressie. Echter, algemeen aangenomen cell-based screening tests richten zich op transcriptionele regulatie, wordt hoofdzakelijk gericht op de identificatie van-promotor targeting moleculen. Hierdoor worden post-transcriptionele mechanismen grotendeels onbedekt door genexpressie gerichte medicijnen. Hier beschrijven we een celgebaseerde analyse gericht op het onderzoeken van de rol van het 3 'onvertaalde gebied (3'UTR) bij de modulatie van het lot van het mRNA, en identificeren van verbindingen kunnen wijzigen. De test is gebaseerd op het gebruik van een luciferase reporter construct dat het 3'-UTR van een gen van belang stabiel geïntegreerd in een ziekte-relevante cellijn. Het protocol bestaat uit twee delen, met als eerste aandachtspunt de primaire screening gericht op de identificatie van moleculen die luciferase activiteit na 24 uur behandeling. Het tweede deel van het protocolbeschrijft de toonbank screening nodig om verbindingen moduleren luciferaseactiviteit bepaald door de 3 'UTR discrimineren. Naast de gedetailleerde protocol en representatieve resultaten bieden we belangrijke overwegingen de assay ontwikkeling en validatie van de hit (s) op het endogene doelwit. De beschreven op cellen gebaseerde reportergentest zal kunnen wetenschappers moleculen modulerende eiwitgehaltes via post-transcriptionele mechanismen afhankelijk van een 3 'UTR identificeren.
Introduction
Lange tijd transcriptionele regulatie van genexpressie werd gedacht een belangrijke, zo niet exclusieve rol bij de controle eiwitproductie spelen. Accumuleren bewijs geeft echter aan dat de post-transcriptionele regulatie draagt zoveel, zo niet meer dan, gentranscriptieregulatie cellulaire eiwitten overvloed 1,2 bepalen. Post-transcriptionele regulatie van genexpressie is veel complexer en uitgebreider dan werd aanvankelijk gedacht. In feite, de verschillende fasen van de post-transcriptionele controle ontstaan worden gereguleerd, waaronder mRNA verwerking, lokalisatie, omzet vertaling 3 en de recent beschreven RNA reversibele methylering 4. Uit een aantal post-transcriptionele regulatie processen mogelijkerwijs betrokken, de assay hieronder beschreven betrekking op die waarin de mRNA 3 'niet-getranslateerde gebied (3'UTR). 3 'UTR breed treft mRNA lot voornamelijk via specifieke interactie van RNA-bindende proteins en niet- coderende RNA's zijn regulerende sequenties en / of secundaire structuren 5. Daarom zullen kleine moleculen die deze interacties veranderen of het stroomopwaartse signaaltransductiewegen het evenwicht dat eiwitgehalte regelt verschuiven. Deze therapeutische aanpak is bijzonder belangrijk voor menselijke pathologieën waarvoor bewijs bestaat blijkt dat ziekte-relevante genen worden onderworpen aan post-transcriptionele regulatie, die dus een potentieel doelwit voor farmacologische interventie. Daarom kunnen-systemen voor het screenen van modulators mRNA 'door interferentie met post-transcriptionele controlemechanismen in een high-throughput format waardevol voor de identificatie van potentiële nieuwe behandelingen geworden.
De beschreven celgebaseerde reportergen assay maakt de identificatie van verbindingen kunnen mRNA lot moduleren via mechanismen afhankelijk zijn 3 'UTR. Het bestaat uit verschillende voornaamste cSPECTEN (Figuur 1) en vereist enkele voorbereidende stappen om de haalbaarheid van de assay te valideren. Allereerst wordt de reporter construct ontworpen om de 3 'UTR van een gen van belang omvatten. De 3 'UTR is gefuseerd aan het einde van een reportergen zoals vuurvlieg luciferase (figuur 1). Wijzigingen in post-transcriptionele mechanismen uitgeoefend door de geplaatste 3'UTR de stabiliteit en / of translatie efficiëntie van deze chimère transcript veranderen, waardoor verschillende luciferase niveaus. Daarom veranderingen in luciferaseactiviteit dienen als indirecte maat van getroffen post-transcriptionele regulatie van het gen van belang. De tweede component van het systeem is een controle reporter construct, een identieke expressieplasmide dat hetzelfde reportergen expressie maar geen 3 'UTR bevat. De twee reporter plasmiden kunnen worden ontworpen in het laboratorium met behulp van conventionele moleculaire biologie protocollen of gekocht van commerciële bronnen.
De keuze van een geschikte cellijn is cruciaal voor de test constructie. Welke cellijn is het optimale model is afhankelijk van tal van factoren, variërend van klinische eisen, zoals maximale gelijkenis met pathologie om gewoon praktische zaken als beschikbaarheid, transfecteerbaarheid, en groei-eigenschappen. Belangrijk voor gaan moet men ervoor zorgen dat fusie van 3 'UTR voor het reportergen heeft een verwachte effect op het niveau van de chimère transcript. De afwezigheid van significante verschillen in luciferase signaal van de 3 'UTR-dragende en controle reporterconstructen transiënt getransfecteerd in de geselecteerde cellen zou aangeven dat de 3' UTR is niet functioneel in dit cellulaire model gevraagd voor het zoeken van alternatieve modellen. Voor de high-throughput formaat, moet de 3 'UTR-dragende en controle luciferase reporter constructen stabiel geïntegreerd in de geselecteerde cellijn. Met een stabiel geïntegreerd over tijdelijk getransfecteerdcellijn voorkeur om verschillende redenen. Dit zal de keuze van een cellulair model inclusief hard-to-transfecteren cellijnen te verbreden, de variabiliteit van de gegevens als gevolg van schommelingen in de transfectie-efficiëntie afnemen, verdwijnen de kosten. Bovendien, na transiënte transfectie cellen worden vaak overbelast met een DNA plasmide leidt tot de verzadiging van het systeem. In deze instellingen een verdere verhoging van de reporter expressie kan lastig zijn, wat resulteert in verminderde gevoeligheid voor potentiële upregulating verbindingen.
Tenslotte, wanneer alle testcomponenten zijn ingesteld, is het essentieel voordat de hoge-doorvoer formaat om de haalbaarheid van de assay, dwz bepalen of luciferaseactiviteit inderdaad op- en neerwaarts gereguleerd via de ingebrachte 3'specifiek kan worden UTR. De beste controles zou kleine moleculen gemeld aan de stabiliteit of vertaalbaarheid van mRNA moduleren door de 3 'UTR van belang. Als het hebben van deze isniet mogelijk is, surrogaat controles imiteren het gewenste effect worden geaccepteerd. Dit kunnen miRNAs of RNA bindende eiwitten bekend om hun effecten uit te oefenen via binding aan de 3 'UTR van belang. Evaluatie van dergelijke controles voor de primaire screening geeft niet alleen de functies van de ontwikkelde assay, maar zorgt ook voor de schatting van het dynamisch bereik, gevoeligheid en prestaties in de high-throughput formaat.
Met behulp van de beschreven protocol we gescreend een 2000-verbinding bibliotheek 6. Neuroblastoma is de meest voorkomende extracraniale vaste tumor van de kindertijd, werd gebruikt als een biologisch model en de 3 'UTR van het MYCN oncogen wiens amplificatie voorspelt sterk negatieve uitkomst van neuroblastoom, een doelgen 7. Figuur 2 beschrijft de experimentele opmaak. De screening was verdeeld in drie runs met de batch grootte van 27 platen gescreend in één run. De partij van 27 platen opgenomen Spectrum collectie bibliotheekplaten n.1-n.8 + N.25 (eerste run), n.9-N.16 + N.25 (tweede run) en N.16-N.24 + N.25 (derde run), elk plaat gescreend in drievoud. Zo is een bibliotheek plaat (n.25) werd bepaald binnen alle drie de punten mogelijk te maken inter-run vergelijking. Onder het protocol beschrijft een enkele run van 9 bibliotheek platen in drievoud getest.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
Referências
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
