Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle
Summary
Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
Abstract
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Introduction
Kwantitatieve nucleïnezuur amplificatie is een belangrijke techniek voor detectie van milieu, voedsel overgedragen en water ziekteverwekkers en klinische diagnostiek. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) is de gouden standaard methode voor gevoelige, specifieke en kwantitatieve detectie van nucleïnezuren, bijvoorbeeld, HIV-1 virale lading testen, detectie van bacteriële pathogenen, en screening op vele andere organismen 1 – 3. Gedurende real-time qPCR, primers amplificeren pathogeen DNA in cycli, en een fluorescent signaal gegenereerd dat evenredig is met de hoeveelheid geamplificeerd DNA in het monster bij elke cyclus. Een monster met een onbekende concentratie van pathogeen DNA kan worden gekwantificeerd met een standaard kromme die de oorspronkelijke DNA-concentratie van standaardmonsters en het tijdstip waarop het fluorescentiesignaal een bepaalde drempel bereikt (dat wil zeggen, de cyclus drempelwaarde, of CT) betrekking heeft.
<p class="Jove_content"> Omdat real-time qPCR vereist dure thermische cycli apparatuur en enkele uren resultaten, alternatieve isothermische amplificatie technieken zoals recombinase polymerase amplificatie (RPA) te ontvangen, ontwikkeld 4. Deze platforms algemeen sneller resultaten en amplificeren van nucleïnezuren een lagere, één temperatuur, die kan worden bereikt met minder dure apparatuur eenvoudiger. RPA, die bijzonder aantrekkelijk voor point-of-care toepassingen, versterkt DNA in minuten vereist een lage versterking (37 ° C) en blijft actief in aanwezigheid van onzuiverheden 5,6. RPA-testen zijn ontwikkeld voor een breed scala van toepassingen, met inbegrip van voedsel analyse, detectie van pathogenen, kanker drug screening en detectie van biothreat agenten 7-12. Echter, gebruik van RPA voor het kwantificeren van nucleïnezuren beperkt 13,14.In eerdere werk, het was shown die real-time kwantitatieve RPA (qRPA) is haalbaar 15. Hier wordt een meer gedetailleerd protocol bedoeld met real-time kwantitatieve RPA onbekende monsters met behulp van een standaardcurve, een methode die analoog is aan kwantificering met qPCR kwantificeren. Dit protocol wordt beschreven hoe een RPA reactie uit te voeren op een thermocycler HIV-1 DNA te detecteren als proof-of-concept, evenals hoe een interne positieve controle (IPC) het systeem correct werkt ontwikkelen. Het verzamelen van gegevens met behulp van een PCR-apparaat of een microscoop en data-analyse voor de bouw van een standaard curve met behulp van training data wordt ook beschreven. Tenslotte wordt de werkwijze voor het kwantificeren van onbekende monsters met de standaardcurve met een douanemanuscript aangetoond. Deze qRPA techniek maakt kwantificering van monsters met onbekende concentraties en heeft vele voordelen boven traditionele real-time qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om een zinvolle kwantificering van gegevens met behulp van de MATLAB-algoritme te verkrijgen, moet de gebruiker de juiste ingang waarden te selecteren wanneer u wordt gevraagd. Na het starten van elk script in de paragrafen 5 en 6, worden alle variabelen automatisch gevraagd in het commando venster en uitgangen worden automatisch gegenereerd. In paragraaf 5.7 wordt de gebruiker gevraagd om een helling drempel selecteren. De waarde van de helling drempel beïnvloedt het kwadraat van de correlatiecoëfficiënt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van de Bill & Melinda Gates Foundation door de Grand Challenges in Global Health Initiative.
Materials
| qRPA Assay | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Software | Vendor | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
Referências
- Yoon, J. -. Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
- Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
- Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a., Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
- Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).
- Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
- Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).
- Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
- Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
- Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642 (2013).
- Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).
- Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).
- Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
- Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
- Sollis, K. a., et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869 (2014).
- . . Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , 1-166 (2011).
