모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
단일 세포 접합자부터 초기 배 발생이 빠른 세포 분열 및 형태 형성을 통해 진행하고, 형태 학적으로 전 구형, 구형, 심장, 어뢰 및 자엽 단계를 특징으로한다. 이 진보적 개발 복잡한 분자 네트워크의 타이트한 규제 받고있다. 개발의 유사한 단계에서 충분한 초기 배아를 수확하는 것은 초기 배아의 세포 및 분자 규제 조사를 위해 필수적이다. Medicago 예 : 팔일이 초기 자엽 단계에 도달 truncatula 동안 초기 배 발생이 짧은 빠른 형태 형성을 거쳐 때문에 이것은 간단하지 않다. 여기서 우리는 두 가지 방법으로 문제를 해결. 첫 번째는 접합체 배아의 단계를 나타내는 데 배아 개발 및 포드 형태 사이의 연결을 설정합니다. 이것은 특히 포드 나선과 등뼈의 개발의 수에 기초한다. 생체의를 보완하는 다른 방법tudies는 체세포 배아를 생산하는 배양 잎 외식를 통해입니다. 매체는 비정상적인 호르몬의 조합을 포함 – 옥신 (1 naphthaleneacetic 산), 사이 토키 닌 (6 benzylaminopurine), 아브 산, 지베렐린 산을. 다른 단계는 절개없이 캘러스의 성장 식별 할 수 있습니다.
Introduction
수확 면적과 총 생산량 1 곡물에 두 번째 콩은 약 20,000 종과 콩과 (또는 콩과 (Fabaceae)) 가족과 함께 고등 식물의 세 번째로 큰 가족입니다. 콩은 세 번째로 큰 재배 작물이다. 곡물 콩류는식이 단백질의 3 분의 1과 인간의 소비를 2 식물성 기름의 3 분의 1에 대해 제공합니다. 자신의 N (2) 고정 용량 콩은 그 씨앗의 자엽 콩, 저장 단백질과 기름처럼. 지속 가능한 농업 시스템에 Medicago의 truncatula 기여 상당한 유전자와 게놈 자원 3,4와 유전자 및 게놈 콩과 식물 모델이다. M. 동안 truncatula는 점점 콩과 식물 씨앗 생물학 5-7 및 배아 8,9을 연구하기 위해 사용 된 콩과 식물 – 근류균 공생 (4) 이해의 발전을 가능하게했다. 애기 배아 광범위 10,11 공부하지만 난되었습니다SA 비 콩과 식물과 배아의 세부 사항은 Medicago 8,10 동일하지 않다. 엠의 접합체 배아 truncatula는 특유의 다세포 뇌하수체, endoployploid suspensor 및 기저 전송 세포 8, 흥미로운 기능을 가지고 있습니다.
체세포 배 (SE)는 일반적으로 식물 (12)를 재생하는 데 사용됩니다. 콩과 식물의 모델 (M)에서 truncatula는, 부모 Jemalong에서 개발 된 종자 라인 Jemalong 2HA (2HA)는 체세포 배 (13)의 높은 비율을 가지고있다. 생성 된 배아의 개수는 최근 실질적 노포 매체 (14)에 모두 산 지베렐린 (GA)과 아브 산 (ABA)을 추가하여 증가하고있다. GA와 ABA는 일반적으로 길항 (14)의 역할을 주어진 특이한 시너지이 경우 GA 및 ABA의 행동합니다. 캘러스로부터 생성 된 배아는 배아의 단계를 용이 visuall 결정될 수 있도록 표면에 개발Y 쉽게 수확. 체세포 배의 조사 (Jemalong) (2HA) 배 발생 및 비 배아있는 동종 라인 근처에 용이 갖는 생체 내에서 서로 다른 실험 가능성을 제공 체외 시스템을 모두 가지고.
배아 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 이해 종자 및 식물 개발을위한 필수적이다. 콩에서 다른 쌍떡잎 식물에서와 같이, 이는 인간의 영양 섭취에 사용되는 제품을 저장 배아 자엽이다. 초기 배 발생이 빠른 세포 분열, 그리고 올바른 배아 패턴을 포함한다. 약 팔일 수정 후, M.에서 truncatula 배아 초기 자엽 단계에 도달한다. 형태 학적 특성은 정확하게 온실 조건의 수정 후 일에 의해 표시되지 않습니다. 따라서, 개발 배아의 무대를 표시 할 수있는 효율적인 표준화 된 접근 방식은 유전 regul 연구에 가치가있다초기 접합체 배아의 ATION.
본 논문에서는 콩과 식물 모델 엠에서 배아의 생물학적 연구 개발 배아를 수집하기 위해 두 개의 표준화 된 프로토콜을 제공 truncatula. 첫 번째를 손쉽게 대형 배아 번호를 제공하기 위해 배양 잎 외식 통해 체세포 배는 배 발생 동안 포드 형태를 연결하여 접합체 배아를 수집하는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명 프로토콜은 상대적으로 정직하고 모든 현대의 세포 및 분자 기술과 콩과 식물 배아의 조사를 할 수 있습니다. 우리는 장점과 생체 내 및 생체 외 접근 모두 단점이 있다는 것을 인정한다. 모두 미숙 씨 (19)의 문화에 비해 초기 배 발생에 더 초점을 수 있습니다.
생체 내 연구의 경우에 무엇을 설명하는 것은 주로 많은 배아 연구에 적합한 포드…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
Referências
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