Protokoller for Innhenting zygotiske og somatiske embryoer for å studere regulering av tidlig embryoutvikling i Model Legume<em> Medicago truncatula</em

Summary

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Abstract

Tidlig embryogenese å starte fra en enkelt celle zygote går gjennom rask celledeling og morfogenese, og er morfologisk kjennetegnet ved pre-globulære, globular, hjerte-, torpedo- og cotyledon etapper. Denne progressive utvikling er under tett regulering av et komplekst molekyl nettverk. Høsting tilstrekkelige tidlige embryoer på et tilsvarende utviklingstrinn er avgjørende for å undersøke cellulært og molekylært regulering av tidlig embryogenesis. Dette er ikke enkelt siden tidlig embryogjennomgår raske morphogenesis i en kort stund f.eks 8 dager for Medicago truncatula å nå tidlig cotyledon scenen. Her tar vi problemet ved to tilnærminger. Den første som etablerer en sammenheng mellom embryo utvikling og pod morfologi i å hjelpe indikere fasen av zygotiske embryo. Dette er spesielt basert på antall pod spiraler og utvikling av piggene. En alternativ måte å utfylle in vivo studies er via dyrkning blad eksplantater å produsere somatiske embryoer. Mediet omfatter en uvanlig kombinasjon hormon – en auxin (1-naftaleneddiksyre), en cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic syre og gibberlinsyre. De ulike stadiene kan skjelnes vokser ut av callus uten disseksjon.

Introduction

Belgfrukter er den tredje største familien av høyere planter med ca 20.000 arter og leguminosae (eller Fabaceae) familie er uten korn i området høstet og total produksjon ^1. Soyabønner er den tredje største dyrket avling. Korn belgfrukter gir om lag en tredjedel av protein og en tredjedel av vegetabilsk olje til konsum ^to. Belgfrukter med sin N ₂ fikseringskapasitet også bidra til bærekraftige landbrukssystemer. Medicago truncatula, som soyabønner, butikker protein og olje i cotyledons av sine frø, og er en genetisk og genomisk legume modell med betydelige genetiske og genomiske ressurser ^3,4. Mens M. truncatula har aktivert fremskritt i forståelsen av belgfrukt-Rhizobium symbiose ⁴ har det blitt stadig mer brukt til å studere legume frø biologi ^5-7 og embryogenese ^8,9. Arabidopsis embryogenese har blitt grundig studert ^10,11, men det jegsa ikke-belgfrukt og detaljene embryogenese er ikke identisk med Medicago ^8,10. Zygotiske embryogenese i M. truncatula har interessante funksjoner, med en særegen flercellet hypofysen, en endoployploid suspensor og basal overføring celle ^8.

Somatisk embryogenese (SE) er ofte brukt for regenerering planter ^12. I legume modellen M. truncatula, til frøet linje Jemalong 2HA (2HA) har blitt utviklet fra den overordnede Jemalong har høy forekomst av somatisk embryogenese ^13. Antall embryoer produseres har nylig blitt hovedsak økt ved å legge både gibberellinsyre (GA) og abscisic syre (ABA) til veletablert medium ^14. I dette tilfellet GA og ABA handle synergi, noe som er uvanlig gitt at GA og ABA vanligvis handle antagonistically ^14. Embryoene produsert fra callus utvikle seg på overflaten, noe som gjør at fasen av embryogenese til lett bestemmes visually og lett høstes. Å ha nær isogene linjer som er embryo (2HA) og ikke-embryo (Jemalong) letter etterforskningen av somatisk embryogenese og ha både in vivo og in vitro-systemer gir ulike eksperimentelle muligheter.

Forstå de cellulære og molekylære mekanismer av embryo utvikling er avgjørende for forståelsen frø og planteutvikling. I belgfrukter, som i andre dicotyledons, er det cotyledons av embryoet som lagrer de produktene som er brukt for human ernæring. Tidlig embryogenese innebærer rask celledeling, og riktig embryo mønster. I ca 8 dager etter befruktning, M. truncatula embryo kommer tidlig cotyledon etapper. Den morfologiske karakterisering er ikke akkurat indikert av dager etter befruktning i glasshouse forhold. Dermed er verdifullt i å studere den genetiske regul en effektiv standardisert tilnærming for å indikere den fasen av utviklings embryoerasjon av tidlig zygotiske embryogenese.

I denne artikkelen gir vi to standardiserte protokoller for å samle utviklings embryoer for biologiske studier av embryogenesen i legume modellen M. truncatula. Den første er å samle zygotiske embryoer ved å knytte embryogenese og pod morfologi, mens den andre er somatisk embryogenese via dyrkning blad eksplantater å gi lett tilgang til store embryo tall.

Protocol

1. zygotiske Embryo Development Plant Material Grow Medicago truncatula villtype Jemalong eller dens nær isogen, svært re-generable genotype Jemalong 2HA 13 (kjent som 2HA) i et glasshus med en 14 timers daglengde og 23 ° C / 19 ° C dag / natt temperatur. Pierce overflaten av frø frakk (med en 23 G nål) før sådde frøet slik at vannet får lov til å gå inn i frø og bløt i vann over natten. Legg nok vann til å fullt ut dekke frøet. Sow tre frø i hv…

Representative Results

For zygotiske embryogenesen forskjellig pod strukturer tilsvarende de forskjellige embryo trinn er vist i figur 1A – F, mens de forskjellige embryo trinn er vist i figur 2A – F. Ved å velge pods på samme nivå, prøver av ovuler som er ganske ensartet kan oppnås (figur 3A). Ved å bruke RT-qPCR embryo spesifikke gener kan lett oppdages og tidsforløp studier evaluert 9. Noe tilleggs disseksjon vil gi rom for videre anrikni…

Discussion

Protokollen beskrevet er relativt rett frem og la etterforskningen av belgfrukt embryogenese med all den moderne cellen og molekylære teknikker. Vi erkjenner at det er fordeler og ulemper ved både in vivo og in vitro tilnærminger. Både tillate mer fokus på tidlig embryo forhold til kultur av umodne frø ^19.

I tilfelle av in vivo studier det som er beskrevet, er hovedsakelig isolering av ovule fra pod som er egnet for mange studier embryo. Det er sel…

Materials

P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable