Protokoller til Indhentning zygotiske og somatiske for studere regulering af Early Embryo Udviklingen i Model Legume<em> Medicago truncatula</em

Summary

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Abstract

Tidlig embryogenese ud fra en enkelt celle zygote går gennem hurtig celledeling og morfogenese, og er morfologisk kendetegnet ved præ-globulære, globulære, hjerte, torpedo og kimblad etaper. Denne gradvise udvikling er under den stramme regulering af et komplekst molekylær netværk. Høst tilstrækkelige tidlige embryoner på et tilsvarende udvikling er afgørende for at undersøge den cellulære og molekylære regulering af tidlig embryogenese. Dette er ikke ligetil, da tidlig embryogenese undergår hurtig morfogenese i en kort tid fx 8 dage for Medicago truncatula at nå den tidlige cotyledon fase. Her løse vi problemet ved to tilgange. Den første etablerer en kobling mellem udvikling embryo og pod morfologi i at hjælpe angive den fase af zygotisk embryo. Dette er især baseret på antallet af pod spiraler og udviklingen af ​​pigge. En alternativ måde at supplere in vivo studies er via dyrkning bladeksplantater at producere somatiske embryoer. Mediet omfatter en usædvanlig hormon kombination – et auxin (1-naphthaleneddikesyre), et cytokinin (6-benzylaminopurin), abscisinsyre og gibberellinsyre. De forskellige trin kan skelnes vokser ud af callus uden dissektion.

Introduction

Bælgfrugter er den tredje største familie af højere planter med ca. 20.000 arter og Leguminosae (eller Fabaceae) familie er andet til korn i området høstet og samlet produktion ^1. Sojabønner er den tredje største dyrkede afgrøde. Bælgplanter giver omkring en tredjedel af kosten protein og en tredjedel af vegetabilsk olie til konsum ^2. Bælgplanter med deres _N2 fastsættelse kapacitet bidrager også til bæredygtige landbrugssystemer. Medicago truncatula, ligesom soja, butikker protein og olie i kimbladene sine frø og er en genetisk og genomisk bælgplanter model med betydelige genetiske og genomiske ressourcer ^3,4. Mens M. truncatula har gjort det muligt fremskridt i forståelsen af bælgplante-Rhizobium symbiose ⁴ er det blevet mere og mere anvendt til at studere frø af bælgplanter biologi ^5-7 og embryogenese ^8,9. Arabidopsis embryogenese er blevet omfattende undersøgt ^10,11, men det jegsa ikke-bælgplanter og detaljerne i embryogenese er ikke identiske med Medicago ^8,10. Zygotisk embryogenese i M. truncatula har interessante funktioner, med en karakteristisk multicellulær hypofysen, en endoployploid Suspensor og basal transfer celle ^8.

Somatisk embryogenese (SE) er almindeligt anvendt til at regenerere planter ^12. I bælgplanter model M. truncatula, frø linje Jemalong 2HA (2HA) er udviklet fra moderselskabet Jemalong at have høje somatisk embryogenese ^13. Antallet af embryoner er for nylig blevet indholdsmæssigt forøget ved tilsætning både gibberellinsyre (GA) og abscisinsyre (ABA) til længe etablerede medium ^14. I dette tilfælde GA og ABA virker synergistisk, hvilket er usædvanligt, GA og ABA gælder almindeligvis antagonistisk ^14. Der er produceret af callus embryoner udvikle sig på overfladen, som tillader den fase af embryogenese til let bestemmes visually og let høstes. Under nær isogene linjer, der er embryogent (2HA) og ikke-embryogenisk (Jemalong) letter undersøgelse af somatisk embryogenese, og som har både in vivo og in vitro-systemer giver forskellige eksperimentelle muligheder.

Forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer i udviklingen embryo er afgørende for forståelsen frø og planter udvikling. I bælgplanter, som i andre tokimbladede, er kimbladene af embryonet at oplagre produkter, som anvendes til human ernæring. Tidlig embryogenese involverer hurtig celledeling, og korrekt embryo mønster. I ca. 8 dage efter befrugtningen, M. truncatula embryo når tidlige cotyledon faser. Den morfologiske karakterisering er ikke ligefrem angivet ved dage efter befrugtningen i drivhusbetingelser. Således en effektiv standardiseret tilgang til at angive den fase af udviklingslandene embryoner er værdifuld i at studere den genetiske regulation af tidlig zygotisk embryogenese.

I dette papir, giver vi to standardiserede protokoller til at indsamle udviklingslandene embryoner til biologiske undersøgelser af embryogenese i bælgplanter model M. truncatula. Den første er at indsamle zygotiske embryoner ved at associere embryogenese og pod morfologi, mens den anden er somatisk embryogenese via dyrkning bladeksplantater at tilvejebringe nemt tilgængelige store embryo tal.

Protocol

1. zygotiske Embryo Development Plantemateriale Grow Medicago truncatula vildtype Jemalong eller dens nær isogen, stærkt igen generable genotype Jemalong 2HA 13 (kendt som 2HA) i et drivhus med en 14 timers fotoperiode og 23 ° C / 19 ° C dag / nat temperatur. Pierce overfladen af ​​frøskal (med en 23 G nål) før såning frøene, så vandet får lov til at komme ind i frø og blød i vand natten over. Tilføj vand nok til fuldt ud at dække frøet. Sow …

Representative Results

For zygotiske embryogenese forskellige pod strukturer svarende til de forskellige embryo faser er vist i figur 1A – F medens de forskellige embryo faser er vist i figur 2A – F. Ved at vælge bælg på samme trin, prøver af frøanlæg, der er helt ensartet kan opnås (figur 3A). Ved anvendelse af RT-qPCR embryo specifikke gener kan let detekteres og tidsforløbet undersøgelser evalueret 9. Nogle ekstra dissektion vil muligg?…

Discussion

De beskrevne protokoller er relativt ligetil og tillade undersøgelse af bælgplante embryogenese med alle moderne celle og molekylære teknikker. Vi anerkender, at der er fordele og ulemper ved både in vivo og in vitro metoder. Begge tillade mere fokus på tidlig embryogenese i forhold til kultur af umodne frø ^19.

I tilfælde af in vivo-undersøgelser, der er beskrevet overvejende isoleringen af ovule fra bælgen som er egnet til mange embryo studier. Det er n…

Materials

P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable