The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Tidlig embryogenese å starte fra en enkelt celle zygote går gjennom rask celledeling og morfogenese, og er morfologisk kjennetegnet ved pre-globulære, globular, hjerte-, torpedo- og cotyledon etapper. Denne progressive utvikling er under tett regulering av et komplekst molekyl nettverk. Høsting tilstrekkelige tidlige embryoer på et tilsvarende utviklingstrinn er avgjørende for å undersøke cellulært og molekylært regulering av tidlig embryogenesis. Dette er ikke enkelt siden tidlig embryogjennomgår raske morphogenesis i en kort stund f.eks 8 dager for Medicago truncatula å nå tidlig cotyledon scenen. Her tar vi problemet ved to tilnærminger. Den første som etablerer en sammenheng mellom embryo utvikling og pod morfologi i å hjelpe indikere fasen av zygotiske embryo. Dette er spesielt basert på antall pod spiraler og utvikling av piggene. En alternativ måte å utfylle in vivo studies er via dyrkning blad eksplantater å produsere somatiske embryoer. Mediet omfatter en uvanlig kombinasjon hormon – en auxin (1-naftaleneddiksyre), en cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic syre og gibberlinsyre. De ulike stadiene kan skjelnes vokser ut av callus uten disseksjon.
Belgfrukter er den tredje største familien av høyere planter med ca 20.000 arter og leguminosae (eller Fabaceae) familie er uten korn i området høstet og total produksjon 1. Soyabønner er den tredje største dyrket avling. Korn belgfrukter gir om lag en tredjedel av protein og en tredjedel av vegetabilsk olje til konsum to. Belgfrukter med sin N 2 fikseringskapasitet også bidra til bærekraftige landbrukssystemer. Medicago truncatula, som soyabønner, butikker protein og olje i cotyledons av sine frø, og er en genetisk og genomisk legume modell med betydelige genetiske og genomiske ressurser 3,4. Mens M. truncatula har aktivert fremskritt i forståelsen av belgfrukt-Rhizobium symbiose 4 har det blitt stadig mer brukt til å studere legume frø biologi 5-7 og embryogenese 8,9. Arabidopsis embryogenese har blitt grundig studert 10,11, men det jegsa ikke-belgfrukt og detaljene embryogenese er ikke identisk med Medicago 8,10. Zygotiske embryogenese i M. truncatula har interessante funksjoner, med en særegen flercellet hypofysen, en endoployploid suspensor og basal overføring celle 8.
Somatisk embryogenese (SE) er ofte brukt for regenerering planter 12. I legume modellen M. truncatula, til frøet linje Jemalong 2HA (2HA) har blitt utviklet fra den overordnede Jemalong har høy forekomst av somatisk embryogenese 13. Antall embryoer produseres har nylig blitt hovedsak økt ved å legge både gibberellinsyre (GA) og abscisic syre (ABA) til veletablert medium 14. I dette tilfellet GA og ABA handle synergi, noe som er uvanlig gitt at GA og ABA vanligvis handle antagonistically 14. Embryoene produsert fra callus utvikle seg på overflaten, noe som gjør at fasen av embryogenese til lett bestemmes visually og lett høstes. Å ha nær isogene linjer som er embryo (2HA) og ikke-embryo (Jemalong) letter etterforskningen av somatisk embryogenese og ha både in vivo og in vitro-systemer gir ulike eksperimentelle muligheter.
Forstå de cellulære og molekylære mekanismer av embryo utvikling er avgjørende for forståelsen frø og planteutvikling. I belgfrukter, som i andre dicotyledons, er det cotyledons av embryoet som lagrer de produktene som er brukt for human ernæring. Tidlig embryogenese innebærer rask celledeling, og riktig embryo mønster. I ca 8 dager etter befruktning, M. truncatula embryo kommer tidlig cotyledon etapper. Den morfologiske karakterisering er ikke akkurat indikert av dager etter befruktning i glasshouse forhold. Dermed er verdifullt i å studere den genetiske regul en effektiv standardisert tilnærming for å indikere den fasen av utviklings embryoerasjon av tidlig zygotiske embryogenese.
I denne artikkelen gir vi to standardiserte protokoller for å samle utviklings embryoer for biologiske studier av embryogenesen i legume modellen M. truncatula. Den første er å samle zygotiske embryoer ved å knytte embryogenese og pod morfologi, mens den andre er somatisk embryogenese via dyrkning blad eksplantater å gi lett tilgang til store embryo tall.
Protokollen beskrevet er relativt rett frem og la etterforskningen av belgfrukt embryogenese med all den moderne cellen og molekylære teknikker. Vi erkjenner at det er fordeler og ulemper ved både in vivo og in vitro tilnærminger. Både tillate mer fokus på tidlig embryo forhold til kultur av umodne frø 19.
I tilfelle av in vivo studier det som er beskrevet, er hovedsakelig isolering av ovule fra pod som er egnet for mange studier embryo. Det er sel…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
Major salts | |||
Minor salts | |||
Vitamins | |||
Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
Plant hormones | |||
1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
Equipment | |||
Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
Sterilising leaves | |||
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |