طرق التثقيف عظم الفخذ الإنسان إإكسبلنتس الأنسجة لدراسة سرطان الثدي الاستعمار خلية للالمتخصصة الإنتقالية
Summary
يتم وصف البروتوكولات لدراسة سرطان الثدي هجرة الخلايا وانتشارها والاستعمار في نسيج العظام نظام نموذجي يزدرع البشري.
Abstract
العظام هو الموقع الأكثر شيوعا لالانبثاث سرطان الثدي. على الرغم من أنه من المقبول على نطاق واسع أن سلوك الخلايا السرطانية المكروية التأثيرات، لا يعرف إلا القليل عن سرطان الثدي خصائص الخلية والسلوكيات داخل المكروية الأم من أنسجة العظام البشرية. لقد قمنا بتطوير المناهج لتتبع وقياس وتعدل خلايا سرطان الثدي البشرية داخل المكروية ل مثقف شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن رؤساء الفخذ التخلص التالية إجمالي العمليات الجراحية لاستبدال مفصل الورك. باستخدام خلايا سرطان الثدي هندسيا لو luciferase تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) التعبير، ونحن قادرون ل quantitate بتكاثر الهجرة وانتشار أنماط باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، والتفاعلات خلية المسار داخل شظايا العظام باستخدام المجهر مضان، وتقييم خلايا الثدي بعد الاستعمار مع التدفق الخلوي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج ما يلي: 1) من مواليد، microe الأنسجة سليمة معمارياnvironment يتضمن أنواع الخلايا الإنسان ذات الصلة، و2) الوصول المباشر إلى المكروية، مما يسهل الكمية السريعة ومراقبة النوعية واضطراب الثدي والخلايا العظمية الخصائص والسلوكيات والتفاعلات. ومن القيود الأساسية، في الوقت الحاضر، هو قابلية محدودة من شظايا الأنسجة، والتي تحصر نافذة الدراسة إلى الثقافة على المدى القصير. وتشمل تطبيقات في النظام النموذجي دراسة البيولوجيا الأساسية للسرطان الثدي وغيرها من الأورام الخبيثة التي تسعى العظام داخل المتخصصة النقيلي، ووضع استراتيجيات علاجية فعالة لاستهداف خلايا سرطان الثدي في أنسجة العظام.
Introduction
ومن المعترف به على نطاق واسع المكروية الورم بأنه حاسم للسلوك الخلايا السرطانية خلال تطور سرطان الثدي النقيلي وتنتشر 1-3. والهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تسهيل دراسة خلايا سرطان الثدي داخل المكروية من النسيج العظمي البشري، الموقع الأكثر شيوعا من سرطان الثدي ورم خبيث 4-6. وتتكون العظام من المقصورات المعادن ونخاع 7-9، وكلاهما تأوي الخلايا وعوامل يفرز المتورطين في تطور النقيلي 10،11. على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع في نماذج الماوس الجسم الحي تسهيل الدراسات المنهجية لعملية النقيلي 12-15، والتفاعلات خلية داخل الهيكل العظمي لا يمكن الوصول إليها بسهولة لمراقبة واضطراب المباشر. نظم نموذج لدراسة وزراعة الأنسجة الماوس العظام وخلايا نخاع الماوس توفر وصول أفضل، وقد أسفرت العديد من الأفكار بشأن الحديث المتبادل والآليات الكامنة وراء خلية سرطان الثدي مetastasis الهيكل العظمي الفئران 16-22. ومع ذلك، فقد أوضحت الدراسات أنه قد يكون هناك أنماط أنواع محددة من osteotropism للأنسجة العظام 23،24. هذه الأنماط يمكن أن تعكس أنواع محددة المتأصلة الاختلافات في خصائص النسيج العظمي، والاختلافات الناجمة عن تغير السكان نخاع العظم في المناعة ناقصة الفئران 11، و / أو سن مبكرة نسبيا من الفئران المستخدمة في التجارب، وكلها المحددات المحتملة للعظم المكروية.
في المختبر النهج لدراسة خلايا سرطان الثدي في الإنسان العظام المشترك الثقافات وركزت عادة على أنواع الخلايا العظمية محددة مثل بانيات المشتقة من نخاع أو خلايا انسجة مثقف كما الطبقات الوحيدة أو داخل النظم نموذج 3-الأبعاد المهندسة 25-35. على الرغم من أن نماذج ثقافة الخلية 2-الأبعاد وقد شكلت الدعامة الأساسية لفي المختبر النهج لأبحاث السرطان، منذ فترة طويلة تم الاعتراف بأن سلوك الخلية يتم تبديل جذري في مonolayer نظم الاستزراع 18،36،37. وقد أدى ذلك إلى تطوير microenvironments المهندسة التي تحاكي تعقيد الأنسجة الحية 3-الأبعاد، بما في ذلك المصفوفة والنماذج القائمة على سقالة مكونة من مواد طبيعية مثل الكولاجين، أو البوليمرات الاصطناعية المصنفة مع أنواع معينة من الخلايا لخلق microenvironments الأنسجة مثل 36-41. وشملت النهج المهندسة أيضا استخدام منصات مفاعل حيوي لمراقبة ودراسة الوسط الهرموني من المكروية 18،19،41-43. على الرغم من أن نماذج المحاكاة البيولوجية والمفاعلات الحيوية توفر العديد من عناصر المكروية الأنسجة المعقدة في الإعداد للرقابة، كما تم تطبيقها بنجاح للمضي قدما في دراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى العظام 18،19،35،42،43، نظم نموذج هندسيا لا تتضمن عموما مجموعة كاملة من أنواع الخلايا ومكونات المصفوفة خارج الخلية الحالية ضمن بيئة العظام الأم.
حتى وقت قريب، وسرطان الثديلم تدرس الخلايا داخل، سليمة، المكروية 3-الأبعاد الأصلية للأنسجة العظام البشرية. نحن ذكرت مؤخرا تطوير نموذج التعاون الثقافة باستخدام شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن استبدال مفصل الورك (THR) جراحة العينات 44. هذه العينات تؤوي كل من المقصورات المعادن ونخاع اللازمة لدراسة الآليات الكامنة الصغرى الانبثاث في الثقافة على المدى القصير. في الأعمال السابقة أنشأنا إثبات صحة المبدأ لاستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) لمراقبة انتشار خلايا سرطان الثدي، معربا عن luciferase المراسل (MDA-MB-231-fLuc) شارك في تربيتها مع شظايا العظام 44. هنا نقدم تفصيلا البروتوكولات التجريبية لدراسة انتشار خلايا الثدي السرطانية، والاستعمار، والهجرة في سياق المكروية الأم باستخدام إإكسبلنتس النسيج العظمي البشري.
لأول مرة نقدم بروتوكول للمشاركة في زراعة خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس الثديتكاثر الخلايا باستخدام BLI. في هذا القسم، والمصنف تعليق خلية الثدي كبقع خلية في 6 لوحات جيدا المجاورة لشظايا العظام، والتي يجمد بواسطة قطعة من الشمع العظام. آبار المراقبة تحتوي على الشمع العظام، ولكن لا شظية العظام. مرة واحدة نعلق البقع الخلية، ويضاف المتوسطة واللوحة هو مثقف لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك كثافة إشارة للإضاءة الحيوية (المرتبطة عدد الخلايا) ويقاس مع BLI. في الخطوة التالية نقدم طرق لخلايا سرطان الثدي زراعة شارك المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار والانتشار. هنا و pipetted تعليق خلية الثدي مباشرة على أجزاء النسيج العظمي، والتي يتم رصدها في الثقافة عن طريق BLI ومضان المجهر مع مرور الوقت لتتبع الاستعمار وعدد الخلايا. في هذه الطريقة، مقصورة نخاع يمكن مسح من شظايا العظام في أي لحظة من الوقت لتحليل خلايا سرطان الثدي مستعمرة من قبل التدفق الخلوي، أو المقايسات الجدوى نخاع.
وبالإضافة إلى ذلك، فإننا ديالكاتب نهجين مختلفين لقياس سرطان الثدي خلية الهجرة. في الطريقة الأولى وترد خطوات لقياس الهجرة نحو supernatants زراعة الأنسجة العظمية. في هذا البروتوكول هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الداخلية، والسطوح العليا من Transwell إدراج الأغشية مع 8 ميكرون حجم المسام (كما هو موضح في الشكل 1A). ثم يتم وضعها على إدراج في لوحة المتلقي مع الآبار التي تحتوي على طاف النسيج العظمي أو السيطرة المتوسطة. وعلى مدار فترة حضانة 20 ساعة، أعداد صغيرة من خلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية إدراج أسفل إلى أقل الآبار زراعة الأنسجة حيث يعلقونها للكشف من قبل BLI. في طريقة الهجرة الثانية هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الدنيا، الأسطح الخارجية للTranswell الأغشية إدراج. توضع شظايا النسيج العظمي في أكواب إدراج وخلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية لاستعمار شظايا العظام (كما هو موضح في الشكل 1B)، والتيثم يتم تصويرها باستخدام BLI.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميهرا وآخرون. وقد سبق وصفها جمع بعد الوفاة وتحليل عينات العظام من مرضى سرطان البروستاتا النقيلي حصادها في وقت تشريح الجثة، وكشف عن الأنسجة عالية الجودة والتحقق من صحة استخدام عينات العظام البشرية لدراسة عملية النقيلي 47. هنا وصفناها بروتوكولات لجمع ومعالج…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذه الدراسات، في جزء منه، من المنح المقدمة من مؤسسة البديل بحوث والتنمية (107588)، والمعهد الوطني للصحة (1U54CA136465-04S1)، وبرنامج بحوث سرطان الثدي كاليفورنيا (201B-0141). نشكر الدكاترة. أندرو ويلبر وR. سكوت ماكيفور للتبرع السخي من هم transponson وPK / hUbiC-SB11 البلازميدات ترانسبوزاز. ونحن نعترف بامتنان جون Tamaresis، دكتوراه للحصول على المشورة على الأساليب الإحصائية، تيموثي براون لأداء التدفق الخلوي، جورجيت هنريك لتقديم المشورة بشأن الهجرات المقايسات، ونانسي Bellagamba لتسهيل جمع العينات THR.
Materials
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
Referências
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an ‘all human’ animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients’ bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
