Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Summary

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Abstract

Bot is de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen. Hoewel het algemeen aanvaard dat de micro-invloeden kankercel gedrag, is er weinig bekend over borstkanker cel eigenschappen en gedragingen binnen de inheemse micro-omgeving van de menselijke botweefsel. We hebben benaderingen op te sporen, te kwantificeren en te moduleren menselijke borstkankercellen in de micro-omgeving van de ontwikkelde gekweekte menselijke botweefsel fragmenten geïsoleerd uit afgedankte femurkoppen na een totale heupprothese chirurgie. Met borstkankercellen ontworpen voor luciferase en versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) expressie, kunnen wij reproduceerbaar kwantificeren migratie en proliferatie patronen met bioluminescentie (BLI), spoor cel interacties binnen de botfragmenten middels fluorescentiemicroscopie en evalueren borstcellen na kolonisatie met flowcytometrie. De belangrijkste voordelen van dit model zijn: 1) een native, architectonisch intact weefsel microenvironment dat relevante menselijke celtypes omvat, en 2) een directe toegang tot de micro-omgeving, die een snelle kwantitatieve en kwalitatieve monitoring en verstoring van de borst en been cel eigenschappen, gedragingen en interacties vergemakkelijkt. Een belangrijkste beperking op dit moment is de eindige levensvatbaarheid van het weefsel fragmenten, die het raam van onderzoek op korte termijn cultuur beperkt. Toepassingen van het modelsysteem omvatten bestuderen de fundamentele biologie van borstkanker en andere bot-zoekende maligniteiten in de metastatische niche en ontwikkeling van therapeutische strategieën om gerichter borstkankercellen in botweefsel.

Introduction

De tumor micro-omgeving wordt algemeen erkend als een kritische determinant van kankercel gedrag tijdens borstkanker progressie en metastatische verspreiden ^1-3. Het doel van de hier voorgestelde methode is het bestuderen van borstkankercellen in het micromilieu van menselijk botweefsel, de meest voorkomende plaats van borstkankermetastasen ^4-6 vergemakkelijken. Bot bestaat uit gemineraliseerd en merg compartimenten ^7-9, beide haven cellen en uitgescheiden factoren betrokken bij metastatische progressie ^10,11. Hoewel veel gebruikt in vivo muismodellen te vergemakkelijken systemische studies van het metastatische proces ^12-15, cel interacties binnen het skelet zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor observatie en directe verstoring. Modelsystemen voor het bestuderen van en het kweken van de muis bot weefsels en muis beenmerg cellen zorgen voor een betere toegang en hebben veel inzichten met betrekking tot overspraak en mechanismen die ten grondslag liggen aan borstkanker cel m opgeleverdetastasis van de muizen skelet ^16-22. Studies hebben echter gesuggereerd dat er mogelijk species-specifieke patronen van osteotropism voor botweefsel ^23,24. Deze patronen kunnen inherent species-specifieke verschillen in botweefsel eigenschappen, die voortvloeien uit veranderde beenmerg populaties in immuun-deficiënte muizen ¹¹ en / of de relatief jonge leeftijd van muizen die voor experimenten, die waarschijnlijk determinanten van het bot weergeeft micro-omgeving.

In vitro technieken voor het bestuderen van borstkankercellen in menselijk bot coculturen zijn doorgaans gericht op specifieke been celtypes zoals beenmerg afgeleide osteoblasten en stromale cellen gekweekt als monolagen of binnen gemanipuleerde 3-dimensionaal modelsystemen ^25-35. Hoewel 2-dimensionele celkweekmodellen de steunpilaar van in vitro gevormd benaderingen voor kankeronderzoek is het al lang erkend dat celgedrag fundamenteel veranderd in monolayer kweeksystemen ^18,36,37. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van gemanipuleerde micro-omgevingen die de complexiteit van 3-dimensionale levende weefsels, zoals matrix- en steiger gebaseerde modellen uit natuurlijke materialen zoals collageen nabootsen, of synthetische polymeren geënt met specifieke celtypen te weefselachtige microenvironments creëren ^36-41. Gemanipuleerde benaderingen hebben ook het gebruik van de bioreactor platforms te controleren en de studie van de hormonale milieu van de micro-omgeving ^18,19,41-43. Hoewel biomimetische modellen en bioreactoren bieden veel elementen van een complex weefsel micro-omgeving in een gecontroleerde omgeving, en zijn met succes toegepast op de studie van de uitzaaiing van borstkanker aan het bot ^{18,19,35,42,43} vooruit, denk engineered modelsystemen in het algemeen niet op te nemen het volledige spectrum van celtypen en extracellulaire matrix componenten aanwezig in het natuurlijk bot milieu.

Tot voor kort, borstkankercellen werden niet bestudeerd in het natieve, intacte, 3-dimensionale micromilieu van menselijke botweefsel. We hebben onlangs meldde de ontwikkeling van een co-cultuur model met behulp van menselijk bot weefselfragmenten geïsoleerd van de totale heupprothese (THR) chirurgie exemplaren ^44. Deze exemplaren haven zowel de gemineraliseerde en merg compartimenten die nodig zijn om mechanismen die ten grondslag liggen micro-uitzaaiingen in korte termijn cultuur te bestuderen. In eerdere werk gevestigde we proof-of-principle voor het gebruik van bioluminescentie beeldvorming (BLI) om de proliferatie van luciferase uiten borstkankercellen (MDA-MB-231-Fluc) samen gekweekt met botfragmenten ⁴⁴ monitoren. Hier presenteren we gedetailleerde experimentele protocollen voor het bestuderen borstcel kanker proliferatie, kolonisatie en migratie binnen het kader van de natieve micro met menselijk bot weefsel explantaten.

Eerst presenteren we een protocol voor co-kweken borstkankercellen grenzend aan botfragmenten om borstvoeding te metencelproliferatie behulp van BLI. In dit hoofdstuk worden borst celsuspensies geënt cel- spots in 6-well platen naast botfragmenten, die worden geïmmobiliseerd door botstukken was. Controle putjes bevatten bot was, maar geen bot fragment. Zodra cel spots te bevestigen, wordt medium toegevoegd en de plaat gekweekt gedurende 24 uur, waarna bioluminescente signaalintensiteit (geassocieerd met het aantal cellen) wordt gemeten BLI. In de volgende stap stellen we methode voor co kweken borstkankercellen direct gezaaid op botfragmenten kolonisatie en proliferatie bestuderen. Hier de borst celsuspensies worden direct gepipetteerd op het botweefsel fragmenten die in kweek worden bewaakt door BLI en fluorescentiemicroscopie tijd kolonisatie en aantal cellen te volgen. In deze werkwijze kan het beenmerg compartiment gespoeld uit de botfragmenten op elk tijdstip voor analyse gekoloniseerde borstkankercellen door flowcytometrie of merg levensvatbaarheid assays.

Daarnaast hebben we Dèschriftgeleerde twee verschillende benaderingen voor het meten van borstkanker cel migratie. In de eerste werkwijze stappen beschreven voor het meten migratie naar botweefsel kweeksupernatanten. In dit protocol borstkanker cellen worden gezaaid op de binnenste bovenvlakken van Transwell voegen membranen met 8 urn poriegrootte (zie figuur 1A). De inserts worden vervolgens geplaatst in een ontvanger plaat met putjes die botweefsel supernatant of controle medium. In de loop van 20 uur incubatieperiode kleine aantallen borstkankercellen migreren door het inzetstuk membranen naar het onderste weefsel kweekputjes wanneer zij hechten voor detectie door BLI. In de tweede migratiemethode borstkanker cellen worden gezaaid op de onderste buitenoppervlakken van Transwell insert membranen. Botweefsel fragmenten worden in de inzetkommen geplaatst en borstkankercellen migreren door de membranen om de botfragmenten koloniseren (zie figuur 1B), dieVervolgens worden afgebeeld met behulp BLI.

Protocol

Femurkoppen werden verzameld van patiënten die een electieve THR chirurgie in de afdeling orthopedische chirurgie aan de Stanford University School of Medicine. Alle weefsels werden verzameld als-de aangewezen exemplaren in overeenstemming met de voorschriften van de Stanford University Research Compliance Office. 1. Het selecteren van een cel Borstkanker Line (s) Verkrijgen of transfecteren de gewenste borstkanker cellijn (s) met een luciferase-GFP reporterconstruct. De volgende experimenten werden …

Representative Results

Isoleren Tissue Fragmenten uit femurkoppen Femurkoppen werden verzameld uit een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke patiënten (44-90 jaar) die een electieve totale heupprothese chirurgie in de afdeling orthopedische chirurgie aan de Stanford University School of Medicine. Elke weggegooid femurkop bevat een klein gedeelte van het bovenste dijbeen, die trabeculair botweefsel uit gemineraliseerde spicules en merg herbergt. Dit weefsel is toegankelijk via het chirurgisch blootgestelde dwars…

Discussion

Mehra et al. Hebben eerder beschreven postmortem verzameling en analyse van bot specimens van uitgezaaide prostaatkanker patiënten geoogst bij de autopsie, waaruit hoogwaardige weefsels en valideren het gebruik van menselijke botsamples het metastatische proces ⁴⁷ bestuderen. Hier hebben we protocollen beschreven voor het verzamelen, verwerken menselijk botweefsel verkregen fragmenten uit afgedankte femurkoppen na THR chirurgie in een korte co-kweeksysteem borst- celmigratie, kolonisatie en prolifer…

Materials

DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)