Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Summary

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Abstract

Bone ist die häufigste Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Obwohl es allgemein, dass der Mikro Einflüsse Krebszellverhalten akzeptiert wird, wird wenig über Brustkrebszell Eigenschaften und Verhaltensweisen in der nativen Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe bekannt. Wir haben Ansätze zu verfolgen, zu quantifizieren und zu modulieren menschlichen Brustkrebszellen in der Mikroumgebung des entwickelten kultivierten menschlichen Knochengewebefragmenten aus gebrauchten Femurköpfe nach Hüft-TEP Operationen isoliert. Verwendung Brustkrebszellen für Luciferase konstruiert und verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) Expression sind wir in der Lage, reproduzierbar zu quantifizieren Migration und Proliferation Muster mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), Spur Zell-Wechselwirkungen innerhalb der Knochenfragmente mittels Fluoreszenzmikroskopie und auszuwerten Brustzellen nach Besiedlung mit Durchflusszytometrie. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind: 1) eine native, architektonisch intaktem Gewebe MicroEnvironment relevanten Zelltypen des Menschen beinhaltet, und 2) direkten Zugriff auf die Mikroumgebung, die eine schnelle quantitative und qualitative Überwachung und Störung der Brust und Knochenzelleigenschaften, Verhaltensweisen und Interaktionen ermöglicht. Eine Haupteinschränkung, derzeit ist die finite Lebensfähigkeit der Gewebefragmente, die das Fenster der Studie, um Kurzzeitkultur beschränkt. Anwendungen des Modellsystems umfassen die Untersuchung der Grundlagen der Biologie von Brustkrebs und anderen Knochensuchmalignomen in der metastatischen Nische, und die Entwicklung therapeutischer Strategien zur zielgerichteter Brustkrebszellen in Knochengewebe.

Introduction

Die Tumor-Mikroumgebung wird weithin als ein kritischer Faktor für die Krebszelle Verhalten bei Brustkrebs Progression und Metastasen erkannt verteilt ^1-3. Das Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist die Untersuchung von Brustkrebs-Zellen in der Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe, die häufigste Stelle der Brustkrebsmetastase ^4-6 erleichtern. Knochen von mineralisierten und Mark Fächer ^7-9, die beide beherbergen Zellen sezerniert Faktoren bei metastasierendem Progression ^10,11 verwickelt zusammen. Obwohl weit verbreitet in vivo Mausmodellen zu erleichtern systemische Studien des metastatischen Prozesses ^12-15, Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Skeletts sind nicht für die Beobachtung und direkten Störung leicht zugänglich. Modellsysteme für die Untersuchung und Kultivierung von Maus-Knochengewebe und Knochenmarkzellen der Maus einen besseren Zugang und haben viele Erkenntnisse über Sprechen und Mechanismen, die Brustkrebs-Zell m ergabetastasis der murinen Gerüst ^16-22. Studien haben jedoch ergeben, dass es artspezifische Muster osteotropism für Knochengewebe ^23,24 sein. Diese Muster inhärent speziesspezifische Unterschiede in der Knochengewebeeigenschaften, von Differenzen aus veränderten Knochenmarkspopulationen in immundefizienten Mäusen ¹¹ und / oder der relativ jungen Alter der Mäuse in Experimenten verwendet, von denen alle voraussichtlich Determinanten des Knochens beziehen könnte Mikroumgebung.

In vitro-Ansätzen zur Untersuchung Brustkrebszellen in menschlichen Knochen Kokulturen wurden typischerweise auf bestimmten Knochenzelltypen wie Mark abgeleiteten Osteoblasten oder Stromazellen als Monolayer kultiviert oder in konstruierte 3-dimensionale Modellsysteme ^25-35 konzentriert. Obwohl 2-dimensionalen Zellkulturmodellen haben die Hauptstütze der in vitro gebildeten Ansätze für die Krebsforschung ist seit langem bekannt, dass das Zellverhalten ist grundsätzlich in m verändertonolayer Kultursystemen ^18,36,37. Dies hat zur Entwicklung von technisch Mikroumgebungen, die die Komplexität von 3-dimensionalen lebenden Geweben, einschließlich Matrix- und Gerüst basierende Modelle von natürlichen Materialien wie Collagen nachahmen geführt, oder synthetische Polymere geimpft mit spezifischen Zelltypen, die gewebeartige Mikroumgebungen zu schaffen ^36-41. Engineered Ansätze haben auch die Verwendung von Bioreaktor Plattformen zu kontrollieren und zu untersuchen das hormonelle Milieu der Mikro ^18,19,41-43. Obwohl biomimetische Modelle und Bioreaktoren bieten viele Elemente eines komplexen Gewebemikroumgebung, in einer kontrollierten Umgebung und wurden erfolgreich angewendet, um die Studie von Brustkrebs Metastasen in Knochen ^{18,19,35,42,43} voranzubringen, müssen entwickelt Modellsysteme in der Regel nicht übernehmen das gesamte Spektrum von Zelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten innerhalb der nativen Knochen Umwelt vorhanden.

Bis vor kurzem BrustkrebsZellen wurden nicht innerhalb der nativen intakten, 3-dimensional-Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe untersucht worden. Vor kurzem berichteten wir die Entwicklung eines Co-Kultur-Modell mit menschlichen Knochengewebefragmenten aus Hüft isoliert (THR) Chirurgie Proben ^44. Diese Proben bergen sowohl die Mineralisierung und Knochenmark Fächer notwendig, Mechanismen Mikrometastasen in Kurzzeitkultur zugrunde zu studieren. In früheren Arbeiten haben wir Proof-of-Prinzip für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), die Proliferation von Luciferase-exprimierenden Brustkrebszellen (MDA-MB-231-Fluc) co-kultiviert mit Knochenfragmente ⁴⁴ zu überwachen. Hier haben wir für das Studium der Brust Zellkrebs Proliferation, Kolonisierung und Migration im Rahmen der nativen Mikroumgebung mit menschlichen Knochen Gewebeexplantaten Gehende bestehende experimentelle Protokolle.

Zuerst ein Protokoll für Co-Kultivierung Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten an Brust messen präsentieren wirZellproliferation mit BLI. In diesem Abschnitt werden die Brustzellsuspensionen Zellflecken in 6-well Platten angrenzend an Knochenfragmente, die durch Stücke von Knochenwachs immobilisiert werden ausgesät. Kontrollvertiefungen enthalten Knochenwachs, aber keine Knochenfragment. Sobald Zellflecken zu befestigen, ist Medium gegeben und die Platte wird für 24 Stunden, nach der Biolumineszenz-Signalintensität (mit Zellzahl assoziiert) mit BLI gemessen kultiviert. Im nächsten Schritt stellen wir Verfahren zur Co-Kultivierung Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente beimpft, um Ansiedlung und Vermehrung zu studieren. Hier werden die Brustzellsuspensionen werden direkt auf die Knochengewebefragmenten, die in Kultur durch BLI und Fluoreszenzmikroskopie über die Zeit überwacht werden, um Kolonisation und Zellzahl verfolgen pipettiert. In diesem Verfahren wird der Markraum kann von den Knochenfragmenten zu jedem Zeitpunkt für die Analyse von kolonisierten Brustkrebszellen durch Durchflusszytometrie gespült werden oder Mark-Lebensfähigkeitstests.

Darüber hinaus haben wir deSchreiber zwei verschiedene Ansätze zur Messung von Brustkrebszellmigration. Im ersten Verfahren wird zur Messung der Migration in Richtung Knochengewebekulturüberständen Schritten beschrieben. In diesem Protokoll die Brustkrebszellen ausgesät werden, auf die inneren, oberen Flächen der Transwell einfügen Membranen mit einer 8 um Porengröße (wie in 1A gezeigt). Die Einsätze werden dann in einer Aufnahmeplatte mit Vertiefungen, die Knochengewebe Überstand oder Kontrollmedium platziert. Im Laufe von 20 Stunden Inkubationszeit eine kleine Anzahl von Brustkrebszellen wandern durch den Einsatz Membranen in die unteren Gewebekulturvertiefungen, wo sie für den Nachweis durch BLI befestigen. In der zweiten Migrations-Verfahren die Brustkrebszellen werden auf die untere Außenflächen Transwell-Einsatz Membranen ausgesät. Knochengewebefragmente werden in die Einsatzschalen gelegt und die Brustkrebszellen wandern nach oben durch die Membranen an den Knochenfragmenten zu kolonisieren (wie in 1B dargestellt), diewerden dann aufgenommen mit BLI.

Protocol

Kugelköpfe wurden von Patienten nach elektiven THR Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Alle Gewebe wurden als de-identifizierte Proben in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Stanford University Research Compliance Office gesammelt. 1. Auswählen einer Brustkrebszelllinie (n) Erhalten oder Transfektion die gewünschte Brustkrebszelllinie (n) mit einem Luciferase-GFP-Reporterkonstrukt. Die folgenden Versuche wurden durc…

Representative Results

Isolieren von Gewebefragmenten aus Hüftköpfe Kugelköpfe wurden aus einer gleichen Anzahl von männlichen und weiblichen Patienten (44-90 Jahre) nach elektiven Hüft-Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Jedes verworfen Hüftkopf enthält einen kleinen Teil des oberen Oberschenkel, die trabekuläre Knochengewebe des mineralisierten Nadeln und Mark zusammen birgt. Dieses Gewebe ist durch die chirurgisch freiQuerSchn…

Discussion

Mehra et al. Wurden bereits beschrieben die Obduktion Sammlung und Analyse von Knochenproben von metastasierendem Prostatakrebs-Patienten zum Zeitpunkt der Autopsie entnommen und enthüllt hochwertigen Gewebe und Validierung der Verwendung von menschlichen Knochenproben, um die metastatischen Prozess ⁴⁷ zu studieren. Hier haben wir Protokolle zur Erhebung, Verarbeitung und Nutzung von menschlichen verworfen Femurköpfe folgenden THR Operation in einer kurzfristigen Co-Kultursystem, um Brustzellmigrat…

Materials

DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)