培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する
Summary
プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。
Abstract
骨は、乳癌転移の最も一般的な部位である。それは広く微小環境に影響を与える癌細胞の挙動が認められているものの、ほとんどは人間の骨組織の天然の微小環境内での乳癌細胞の特性および動作について知られている。我々は、追跡定量化の微小環境内でのヒト乳癌細胞を調節するためのアプローチを開発した人工股関節全置換手術の後に廃棄された大腿骨頭から単離された培養されたヒト骨組織断片。ルシフェラーゼおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のために操作乳癌細胞を用いて、我々は、再現性生物発光イメージング（BLI）を用いて、遊走および増殖パターンを定量することができ、蛍光顕微鏡を用いて、骨片内のトラックの細胞の相互作用、および後の乳癌細胞を評価するフローサイトメトリーでのコロニー形成。このモデルの主な利点は、1）ネイティブ、アーキテクチャ的に無傷組織のマイクロE関連するヒト細胞型を含み、かつ迅速な定量的および定性的な監視と乳癌および骨細胞の性質、行動や相互作用の摂動を促進する微小環境、2）直接アクセスnvironment。主要な制限は、現在では、短期培養の研究のウィンドウを閉じ込める組織断片、有限の生存能力である。モデルシステムのアプリケーションは、乳癌および転移性のニッチ内の他の骨求め悪性疾患の基礎生物学を研究し、効果的に骨組織中の乳癌細胞を標的とする治療戦略の開発を含む。
Introduction
腫瘍微小環境は広く、乳癌の進行および転移拡散1-3中の癌細胞の挙動の重要な決定因子として認識されている。ここに提示された方法の目的は、人間の骨組織、乳癌転移4-6の最も頻繁な部位の微小環境内での乳癌細胞の研究を容易にすることである。骨は、細胞と転移進行10,11に関与する分泌因子を抱くどちらも、鉱化と骨髄コンパートメント7-9で構成されている。広く生体マウスモデルで使用されるが、転移プロセス12-15の全身研究を促進、スケルトン内の細胞の相互作用は観察と直接摂動のために容易にアクセスすることはできません。マウス骨髄組織およびマウス骨髄細胞がより良いアクセスを提供し、クロストークおよび乳癌セルmのメカニズムに関する多くの知見が得られている研究及び培養するためのモデル系ネズミスケルトン16-22のetastasis。しかし、研究は、骨組織23,24のためosteotropismの種特異的なパターンが存在し得ることを示唆している。これらのパターンは、骨の可能性の決定因子である全てが骨組織の特性に固有の種特異的な差異は、免疫欠損マウス11、及び/又は実験に使用したマウスは、比較的若い年齢で変化した骨髄集団から得られた差を反映している可能性が微小環境。
インビトロでは 、典型的には、骨髄由来の骨芽細胞または単層として培養された間質細胞として、または操作された3次元モデル系25〜35内の特定の骨の細胞型に焦点を当ててきたヒト骨共培養において乳癌細胞を研究するために近づく。 2次元の細胞培養モデルは、in vitroでの柱を形成し、がん研究のために近づいているが、それは長い細胞の挙動は基本メートルに変更されることが認識されている培養系18,36,37 onolayer。これは、コラーゲンのような天然材料からなるマトリックス – 足場ベースのモデルを含む3次元の生体組織の複雑性を模倣工学的微小環境が開発された、または合成ポリマーが組織様微小環境を作成するために特定の細胞型を播種36-41。工学的ア プローチも制御し、微小環境18,19,41-43のホルモン環境を研究するためのバイオリアクタープラットフォームの使用が含まれている。バイオミメティックモデル及びバイオリアクターを制御する設定で複雑 な組織微小環境の多くの要素を提供し、成功した骨18,19,35,42,43の乳癌転移の研究を進めるために適用されているが、操作されたモデル系は、一般的に内蔵されていない天然の骨の環境内に存在する細胞型および細胞外マトリックス成分の全スペクトル。
最近まで、乳癌細胞は、ヒト骨組織の天然の、無傷の、3次元微小環境内で検討されていない。我々は最近、（THR）手術が44標本人工股関節全置換から単離されたヒト骨組織フラグメントを用いた共培養モデルの開発を報告した。これらの標本は、短期培養でマイクロ転移のメカニズムを研究するために必要な鉱化と骨髄コンパートメントの両方を抱く。以前の研究では、骨片44（MDA-MB-231-Fluc細胞）とを共培養し、ルシフェラーゼを発現する乳癌細胞の増殖をモニターするために生物発光イメージング（BLI）を使用するための原理の証明を確立した。ここでは、乳癌細胞癌の増殖、コロニー化、及びヒト骨組織外植片を使用して、ネイティブの微小環境のコンテキスト内での移行を研究するための詳細な実験プロトコルを提示する。
まず、乳房を測定するための骨片に隣接する共培養乳癌細胞のためのプロトコルを提示BLIを使用して細胞増殖。このセクションでは、乳房の細胞懸濁液を骨ろう片により固定される骨片に隣接する6ウェルプレート中の細胞スポットとして播種する。対照ウェルは、骨のワックス、ない骨片が含まれている。セルスポットがアタッチすると、培地を添加し、プレートをBLIにより測定される生物発光シグナル強度（細胞数に関連する）、その後24時間、培養されている。次のステップでは、コロニー形成および増殖を研究するために、骨片に直接播種共培養乳癌細胞のための方法を提示する。ここでは、乳房細胞懸濁液をコロニー形成細胞数を追跡するために時間をかけてBLI、蛍光顕微鏡により培養物中に監視された骨組織断片上に直接ピペットで移す。この方法では、骨髄区画は、フローサイトメトリー、または骨髄生存率アッセイによりコロニー形成さ乳癌細胞の解析のために任意の時点での骨片から洗い流すことができる。
さらに、我々はデ乳癌細胞遊走を測定するための2つの異なるアプローチをスクライブ。第一の方法のステップは、骨組織培養上清に向かって移動を測定するために概説されている。このプロトコルでは、乳癌細胞は、内側に播種され、トランスウェルの上面は、（ 図1Aに示されるように）8μmの孔径を有する膜を挿入する。挿入物は、次いで、骨組織上清または対照培地を含有するウェルを有する受け板内に配置される。 20時間のインキュベーション期間にわたって、乳癌細胞の少数がダウンそれらがBLIによる検出に取り付ける下部組織培養ウェルへの挿入膜を通って移動する。第二の移行方法で乳癌細胞をトランスウェルインサート膜の下側、外表面上に播種される。骨組織断片を挿入カップおよび乳癌細胞内に配置される（ 図1Bに示すように）骨片にコロニーを形成するために、膜を通って移行し、これその後、BLIを使用して画像化される。
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehra らは以前に、高品質の組織を明らかにし、転移プロセス47を研究するためのヒト骨髄サンプルの使用を検証し、剖検時に採取し、転移性前立腺癌患者の骨片の死後の収集と分析を記載している。ここでは、収集、処理および乳癌細胞移動、コロニー形成及び増殖を研究するための短期共培養系におけるTHR手術後の破棄大腿骨頭から得られたヒト骨組織の断片を使用するた?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの研究は、部分的には、オルタナティブ研究開発財団（107588）、国立衛生研究所（1U54CA136465-04S1）、およびカリフォルニア乳がん研究プログラム（201B-0141）からの補助金により、賄われた。私たちは、博士に感謝。彼らの寛大な寄付のためのアンドリュー·ウィルバーとR.スコット·マッキバー transponsonおよびPK / hUbiC-SB11トランスポザーゼプラスミド。私たちは感謝ジョンTamaresis、博士号を認めるTHR標本の収集を容易にするための統計的手法、移行のアッセイにアドバイスをフローサイトメトリー、ジョーゼットHenrichを実行するためのティモシー·ブラウン、そしてナンシーBellagamba上のアドバイス。
Materials
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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