Metoder for dyrking Menneskelig Femur Tissue eksplantater å studere Breast Cancer Cell Kolonisering av metastatisk nisje

Summary

Protokoller er beskrevet for å studere brystkreft cellemigrering, proliferasjon og kolonisering i en human bone vevseksplantatet modellsystem.

Abstract

Bone er den mest vanlige område av brystkreft metastase. Selv om det er allment akseptert at mikromiljøet påvirker kreftcelle atferd, er lite kjent om brystkreft celle egenskaper og atferd innenfor den opprinnelige mikromiljøet av menneskelig benvev. Vi har utviklet metoder for å spore, kvantifisere og modulerer menneskelige brystkreft celler innenfor mikromiljøet av dyrkede humane bein vevfragmenter isolert fra kasserte femoral hoder følgende totale hip erstatning surgeries. Ved hjelp av brystkreft celler konstruert for luciferase og forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) uttrykk, er vi i stand til reproduserbart quantitate migrasjon og spredning mønstre ved hjelp Bioluminescens bildebehandling (BLI), spor celle interaksjoner innenfor bein fragmenter som bruker fluorescens mikroskopi, og evaluere bryst celler etter kolonisering med flowcytometri. De viktigste fordelene med denne modellen inkluderer: 1) en innfødt, arkitektonisk intakt vev microenvironment som inkluderer relevante humane celletyper, og 2) direkte tilgang til mikromiljøet, som muliggjør hurtig kvantitativ og kvalitativ overvåking og forstyrrelse av bryst og bein celle egenskaper, atferd og interaksjoner. En primær begrensning, i dag, er den endelige levedyktighet av vevfragmenter som begrenser vinduet i studien til korttidskultur. Anvendelser av modellsystemet omfatter å studere den grunnleggende biologi av brystkreft og andre bein-søkende maligniteter i metastatisk nisje, og utvikling av terapeutiske strategier for effektivt å målrette brystkreftceller i benvev.

Introduction

Svulsten mikromiljøet er anerkjent som en kritisk faktor for kreft celle oppførsel under brystkreft progresjon og metastatisk spre ^1-3. Målet med fremgangsmåten presentert her er å forenkle studiet av brystkreftceller i mikromiljøet av humant benvev, den hyppigste stedet for brystkreft metastase ^4-6. Bein består av mineralisert og marg avdelinger ^7-9, som begge bærer på celler og skilles faktorer involvert i metastatisk progresjon ^10,11. Selv om mye brukt in vivo musemodeller lette systemiske studier av metastatisk prosess ^12-15, celle interaksjoner innenfor skjelettet er ikke lett tilgjengelig for observasjon og direkte forstyrrelse. Modellsystem for å studere og dyrking mus bein vev og mus marg cellene gi bedre tilgang og har gitt mange innsikt om crosstalk og mekanismene bak brystkreft celle metastasis i muse skjelett ^16-22. Men studier har antydet at det kan være artsspesifikke mønstre av osteotropism for benvev ^23,24. Disse mønstrene kan reflektere iboende artsspesifikke forskjeller i beinvevet egenskaper, forskjeller som følge av endrede benmargs populasjoner i immun-mangelfull mus ^11, og / eller den relativt ung alder av mus brukt i eksperimenter, som alle er sannsynlige faktorer som bestemmer beinet mikromiljøet.

In vitro tilnærminger for å studere brystkreft celler i menneskelige bein co-kulturer har vanligvis fokusert på bestemte bein celletyper som marg-avledet osteoblaster eller stromale celler dyrket som monolayers eller innen utviklet tre-dimensjonale modellsystemer ^25-35. Selv om to-dimensjonale cellekultur modeller har dannet bærende for in vitro tilnærminger for kreftforskning, har det lenge vært kjent at celle atferd er fundamentalt endret på monolayer kultursystemer ^18,36,37. Dette har ført til utvikling av konstruerte mikromiljøer som etterligner kompleksiteten av 3-dimensjonale levende vev, inkludert matrise- og stillabaserte modeller sammensatt av naturlige materialer slik som kollagen eller syntetiske polymerer podet med spesifikke celletyper for å lage vev-lignende microenvironments ^36-41. Konstruert tilnærminger har også omfattet bruk av bioreaktor plattformer for å kontrollere og studere den hormonelle miljøet av mikromiljøet ^18,19,41-43. Selv biomimetic modeller og bioreaktorer gi mange elementer av en kompleks vev mikromiljøet i et kontrollert miljø, og har blitt brukt til å fremme studiet av brystkreft metastaser til bein ^{18,19,35,42,43,} trenger konstruerte modellsystemer generelt ikke innlemme det fulle spektrum av celletyper og ekstracellulære matriks-komponenter som er tilstede i naturlig ben miljø.

Inntil nylig, brystkreftceller har ikke blitt studert innenfor de innfødte, intakt, 3-dimensjonal mikromiljøet av menneskelige bein vev. Vi har nylig rapportert utviklingen av en co-kultur modell ved hjelp av menneskelige bein vevfragmenter isolert fra total hofteprotese (THR) kirurgi eksemplarer ^44. Disse prøvene havna både mineralisert og marg avdelinger er nødvendig for å studere mekanismene bak mikrometastaser i kort sikt kultur. I tidligere arbeid etablerte vi proof-of-prinsippet for å bruke Bioluminescens imaging (BLI) for å overvåke spredning av luciferase-uttrykke brystkreftceller (MDA-MB-231-Fluc) co-dyrket med bein fragmenter ^44. Her presenterer vi detaljerte eksperimentelle protokoller for å studere bryst celle kreft spredning, kolonisering, og migrasjon innenfor rammen av den opprinnelige mikromiljøet ved hjelp av menneskelig benvev eksplantater.

Først presenterer vi en protokoll for co-dyrking brystkreftceller som grenser til bein fragmenter å måle brystcelleproliferasjon bruker BLI. I denne delen er bryst cellesuspensjoner seeded som celle flekker i seks-brønns plater i tilknytning til bein fragmenter, som er immobilisert av biter av bein voks. Kontrollbrønner inneholder ben voks, men ingen benfragment. Når celle flekker feste, er medium tilsatt og platen blir dyrket i 24 timer, hvoretter bioluminescent signalintensitet (assosiert med cellenummer) måles med BLI. I det neste trinn presenteres fremgangsmåter for co-dyrkning av brystkreftceller sådd direkte på beinfragmenter for å studere kolonisering og proliferasjon. Her brystcellesuspensjoner blir pipettert direkte på benvevet fragmenter, som overvåkes i kultur av BLI og fluorescensmikroskopi over tid for å spore kolonisering og cellenummeret. I denne metoden, kan margen rommet spyles fra benfragmentene som helst punkt for analyse av koloniserte brystcancerceller ved strømningscytometri, eller marg levedyktighet assays.

I tillegg har vi deskriftlærd to ulike tilnærminger for å måle brystkreft celle migrasjon. I den første metoden trinnene er beskrevet for måling av migrering mot benvev kultursupernatanter. I denne protokoll brystkreftcellene sådd ut på den indre, øvre overflater av Transwell sette membraner med 8 um porestørrelse (som vist i figur 1A). Innsatsene blir deretter plassert inn i en mottaker plate med brønner inneholdende benvev supernatant eller kontrollmedium. I løpet av en 20-timers inkuberingsperiode, små antall av brystkreft celler migrerer gjennom innsatsen membraner ned i de lavere vevs kulturbrønner hvor de fester for deteksjon av BLI. I den andre overføringsmetode brystkreftcellene sådd ut på den nedre, ytre overflater av Transwell insert membraner. Benvev fragmenter plasseres i innsatsen kopper og brystkreft celler migrerer opp gjennom membranene til å kolonisere benfragmentene (som vist på figur 1B), hvilkeblir deretter avbildes med BLI.

Protocol

Femoral hoder ble samlet inn fra pasienter som gjennomgår elektiv THR kirurgi ved Institutt for ortopedisk kirurgi ved Stanford University School of Medicine. Alle vev ble samlet som avidentifiserte prøver i henhold til forskrifter om Stanford University Research Compliance Office. 1. Velge en Breast Cancer Cell linje (r) Innhente eller transfektere den ønskede brystkreft-cellelinje (r) med en luciferase-GFP reporter-konstruksjonen. De følgende eksperimenter ble utført ved anvendelse av MDA-MB-23…

Representative Results

Isolere Tissue Fragmenter fra Lårarterier Heads Femoral hoder ble samlet inn fra like mange mannlige og kvinnelige pasienter (44-90 år) som gjennomgår elektiv total hofteprotesekirurgi ved Institutt for ortopedisk kirurgi ved Stanford University School of Medicine. Hver kastes lårbenshodet inneholder en liten del av det øvre lårbenet, som havner trabekulært ben vev sammensatt av mineralisert spicules og marg. Dette vev er tilgjengelig gjennom kirurgisk eksponert tverrsnitt av skaftet …

Discussion

Mehra et al., Har tidligere beskrevet en postmortem innsamling og analyse av prøver fra beinmetastatisk prostata kreftpasienter høstet ved tidspunktet for autopsi, avslører høykvalitets vev og validere anvendelse av humane ben prøver for å studere den metastatiske prosess ^47. Her har vi beskrevet protokoller for innsamling, bearbeiding og bruk av menneskelige bein vev fragmenter hentet fra kasserte femoral hoder følgende THR kirurgi i et kortsiktig co-kultur system for å studere bryst celle m…

Materials

DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)