Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Summary

Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante.

Abstract

Óssea é o local mais comum de metástase do câncer de mama. Embora seja amplamente aceito que o comportamento de células de câncer influências microambiente, pouco se sabe sobre as propriedades das células de câncer de mama e comportamentos dentro do microambiente nativa do tecido ósseo humano. Nós desenvolvemos abordagens para acompanhar, quantificar e modulam as células de câncer de mama humanos dentro do microambiente de fragmentos humanos cultivados tecido ósseo isoladas de cabeças femorais descartados seguintes artroplastias totais de quadril. Usando células de câncer de mama projetados para luciferase e aprimorados proteína fluorescente (EGFP) expressão verde, somos capazes de quantificar reproducibly migração e proliferação padrões usando imagem de bioluminescência (BLI), as interações celulares pista dentro dos fragmentos ósseos através de microscopia de fluorescência, e avaliar as células da mama após colonização por citometria de fluxo. As principais vantagens deste modelo incluem: 1) a, microe nativa tecido arquitetura intactanvironment que inclui tipos de células humanas relevantes, e 2) o acesso directo ao microambiente, o que facilita quantitativa rápida e monitoramento qualitativo e perturbação de propriedades, comportamentos e interações de mama e de células ósseas. Uma limitação primária, na presente, é a viabilidade finita dos fragmentos de tecido, que confinam a janela de estudo à cultura de curto prazo. Aplicações do sistema de modelo incluem o estudo da biologia básica do câncer de mama e outros tumores malignos de osso buscando dentro do nicho metastático, e desenvolver estratégias terapêuticas para efetivamente como alvo as células de câncer de mama em tecidos ósseos.

Introduction

O microambiente do tumor é amplamente reconhecido como um fator determinante para o comportamento de células de câncer durante a progressão do câncer de mama metastático e espalhar ^1-3. O objetivo do método aqui apresentado é o de facilitar o estudo de células de câncer de mama, no microambiente do tecido ósseo humano, o local mais comum de metástase do câncer de mama ^4-6. O osso é composto por mineralizado e medula compartimentos ^7-9, tanto de células que abrigam e factores segregados implicados na progressão metastática ^10,11. Embora amplamente utilizado em modelos in vivo rato facilitar estudos sistêmicos do processo metastático ^12-15, interações celulares dentro do esqueleto não são facilmente acessíveis para observação e perturbação direta. Sistemas modelo para estudar e cultivar tecidos ósseos do mouse e as células da medula do mouse proporcionar um melhor acesso e têm rendido muitos insights em relação crosstalk e mecanismos subjacentes células do cancro da mama metastasis do esqueleto murino ^16-22. No entanto, estudos sugerem que pode haver modelos de osteotropism específicas das espécies para o tecido ósseo ^23,24. Esses padrões podem reflectir espécie-específicos inerentes diferenças nas propriedades do tecido ósseo, as diferenças resultantes de populações de medula óssea alterados em imuno-deficiente camundongos ^11, e / ou a idade relativamente jovem de ratos utilizados em experimentos, os quais são possíveis determinantes do osso microambiente.

In vitro abordagens para estudar as células de cancro da mama em co-culturas de ossos humanos têm tipicamente focada em tipos específicos de células de osso tais como os osteoblastos derivados de medula óssea ou de células do estroma cultivadas como monocamadas ou dentro engenharia sistemas modelo 3-dimensional ^25-35. Embora os modelos de cultura de células 2-dimensional formaram o esteio da in vitro se aproxima para pesquisa do câncer, tem sido reconhecido que o comportamento da célula é fundamentalmente alterada em monolayer sistemas de cultura ^18,36,37. Isto levou ao desenvolvimento de microambientes modificados que imitam a complexidade dos tecidos vivos 3-dimensionais, incluindo matriz- e modelos baseados em compostos de andaime de materiais naturais, tais como colagénio, polímeros sintéticos ou semeadas com tipos específicos de células para criar microambientes tecido semelhante ^36-41. Abordagens de engenharia também incluíram a utilização de plataformas de biorreatores para controlar e estudar o ambiente hormonal do microambiente ^18,19,41-43. Embora os modelos biomiméticos e biorreatores proporcionar muitos elementos de um microambiente tecido complexo em um ambiente controlado, e têm sido aplicados com sucesso para avançar no estudo da metástase do câncer de mama para os ossos ^{18,19,35,42,43,} sistemas de modelos de engenharia em geral, não incorporam o espectro de tipos de células e componentes da matriz extracelular presentes no ambiente do osso nativo.

Até recentemente, o câncer de mamaAs células não foram estudados no microambiente nativa intacta,, 3-dimensional do tecido ósseo humanos. Nós informou recentemente o desenvolvimento de um modelo de co-cultura utilizando fragmentos de tecidos ósseos humanos isolados de substituição total do quadril (THR) cirurgia espécimes ^44. Estes espécimes abrigar tanto os compartimentos mineralizados e medula necessárias para estudar os mecanismos subjacentes micro-metástases em cultura de curto prazo. Em trabalho anterior estabelecemos prova de princípio para a utilização de imagem de bioluminescência (BLI) para monitorar a proliferação de células de câncer de mama que expressam luciferase (MDA-MB-231-FLUC) co-cultivadas com fragmentos de ossos ^44. Aqui apresentamos detalhado protocolos experimentais para estudar a proliferação das células do cancro da mama, colonização e migração no contexto do microambiente nativa a partir de explantes de tecido ósseo humano.

Primeiro apresentamos um protocolo para as células do câncer de mama co-cultura adjacentes a fragmentos de ossos para medir mamaproliferação celular utilizando BLI. Neste ponto, as suspensões de células da mama são semeadas como manchas de células em placas de 6 poços adjacentes aos fragmentos de osso, que são imobilizadas por pedaços de cera de osso. Os poços de controlo contêm cera de osso, mas nenhum fragmento ósseo. Uma vez que os pontos de células de anexar, o meio é adicionado e a placa é cultivada durante 24 h, após as quais a intensidade do sinal bioluminescente (associada com o número de células) é medida com BLI. No passo seguinte, apresenta-se métodos para células de cancro da mama co-cultura semeadas directamente sobre os fragmentos ósseos para estudar a colonização e proliferação. Aqui, as suspensões de células da mama são pipetados diretamente sobre os fragmentos de tecidos ósseos, que são monitoradas em cultura por BLI e microscopia de fluorescência ao longo do tempo para acompanhar a colonização e número de células. Neste método, a medula do compartimento podem ser retirados a partir dos fragmentos ósseos, em qualquer ponto de tempo para análise de células de cancro da mama colonizados por citometria de fluxo, ensaios de viabilidade ou medula.

Além disso, desescriba duas abordagens diferentes para medir a migração de células de câncer de mama. No primeiro método passos são descritos para medir a migração para os sobrenadantes de cultura de tecido ósseo. Neste protocolo as células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies superiores dos interiores, Transwell inserir membranas com um tamanho de poro de 8 um (como mostrado na Figura 1A). As pastilhas são depois colocadas numa placa de receptor com poços contendo o sobrenadante de tecido ósseo ou meio de controlo. Ao longo de um período de incubação de 20 h, um pequeno número de células de cancro da mama migram através das membranas de inserção para dentro dos poços de cultura de tecidos mais baixos, onde eles se ligam para detecção pela BLI. No segundo método de migração de células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies inferiores exteriores, de membranas Transwell de inserção. Fragmentos de tecido ósseo são colocados em copos de inserção e as células de cancro da mama migrar para cima através das membranas para colonizar os fragmentos de osso (como mostrado na Figura 1B), o quesão então fotografada usando BLI.

Protocol

Cabeças femorais foram coletadas de pacientes submetidos à cirurgia eletiva THR no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. Todos os tecidos foram coletadas como espécimes identificados-de, em conformidade com a regulamentação do Compliance Office Research da Universidade de Stanford. 1. Seleção de uma linha (s) celular do cancro da mama Obter ou transfectar a linha celular de cancro da mama desejada (s) com uma construção repórter de luciferase…

Representative Results

Isolamento de fragmentos de tecido de cabeças femorais Cabeças femorais foram coletados a partir de um número igual de pacientes do sexo feminino (44-90 anos) submetidos a artroplastia electiva total da anca no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford e masculinos. Cada cabeça femoral descartada contém uma pequena porção do fêmur superior, que abriga tecido ósseo trabecular composto por espículas mineralizados e medula. Este tecido é a…

Discussion

Mehra et ai. Descreveram anteriormente a recolha post-mortem e análise de amostras de osso de pacientes com cancro da próstata metastático colhidas no momento de autópsia, revelando tecidos de alta qualidade e validação do uso de amostras de ossos humanos para estudar o processo metastático ^47. Aqui descrevemos protocolos para a coleta, processamento e utilização de fragmentos de tecidos ósseos humanos obtidos a partir de cabeças femorais descartados após a cirurgia THR em um sistema de c…

Materials

DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)