Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Summary

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Abstract

El hueso es el sitio más común de metástasis del cáncer de mama. Aunque es ampliamente aceptado que el comportamiento de las células del cáncer de influencias microambiente, poco se sabe acerca de las propiedades celulares de cáncer de mama y comportamientos dentro del microambiente natural de tejido óseo humano. Hemos desarrollado enfoques para realizar el seguimiento, cuantificar y modular las células de cáncer de mama humano en el microambiente de fragmentos humanas cultivadas de tejido óseo aisladas de cabezas femorales desechados después de cirugía de reemplazo total de cadera. El uso de células de cáncer de mama de ingeniería para la luciferasa y la proteína fluorescente (EGFP) expresión verde mejoradas, somos capaces de cuantificar de forma reproducible la migración y proliferación de patrones de uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI), interacciones celulares pista dentro de los fragmentos de hueso mediante microscopía de fluorescencia, y evaluar las células del seno después la colonización con citometría de flujo. Las principales ventajas de este modelo son: 1) a, microE tejido arquitectónico intacto nativambiente que incluye tipos de células humanas pertinentes, y 2) el acceso directo al microambiente, lo que facilita cuantitativo rápido y monitoreo cualitativo y perturbación de mama y de células óseas propiedades, comportamientos e interacciones. Una limitación principal, en la actualidad, es la viabilidad finito de los fragmentos de tejido, lo que limita la ventana del estudio de cultivo a corto plazo. Aplicaciones del sistema de modelo incluyen el estudio de la biología básica del cáncer de mama y otros tumores malignos por el hueso dentro del nicho metastásico, y el desarrollo de estrategias terapéuticas para orientar eficazmente las células de cáncer de mama en los tejidos óseos.

Introduction

El microambiente tumoral es ampliamente reconocida como un determinante crítico de la conducta de células de cáncer durante la progresión del cáncer de mama metastásico y repartidas ^1-3. El objetivo del método que aquí se presenta es la de facilitar el estudio de las células de cáncer de mama en el microambiente del tejido óseo humano, el sitio más frecuente de metástasis del cáncer de mama ^4-6. El hueso se compone de compartimentos mineralizadas y médula ósea ^7-9, ambos de los cuales albergan células y factores secretados implicados en la progresión metastásica ^10,11. Aunque es ampliamente utilizado pt modelos in vivo de ratón facilitar estudios sistémicos del proceso metastásico ^12-15, interacciones de las células dentro del esqueleto no son de fácil acceso para la observación y la perturbación directa. Sistemas de modelo para el estudio y el cultivo de tejidos óseos ratón y células de médula de ratón proporcionan un mejor acceso y han dado muchas ideas con respecto a la interferencia y los mecanismos que subyacen a las células del cáncer de mama metastasis del esqueleto murino ^16-22. Sin embargo, los estudios han sugerido que puede haber patrones de osteotropism específicas de la especie por el tejido óseo ^23,24. Estos patrones podrían reflejar especies específicas inherentes diferencias en las propiedades del tejido óseo, las diferencias resultantes de poblaciones de médula ósea alterados en ratones inmunodeficientes ^11, y / o la edad relativamente joven de los ratones utilizados en los experimentos, todos los cuales son posibles determinantes de la médula microambiente.

In vitro enfoques para el estudio de las células de cáncer de mama en co-cultivos óseos humanos se han centrado generalmente en los tipos de células óseas específicas tales como osteoblastos derivados de médula o de células estromales cultivadas como monocapas o dentro de la ingeniería de sistemas modelo de 3 dimensiones ^25-35. Aunque los modelos de cultivo de células de 2 dimensiones han formado la base del in vitro enfoques para la investigación del cáncer, desde hace tiempo se ha reconocido que el comportamiento celular se altera fundamentalmente en monolayer sistemas de cultivo ^18,36,37. Esto ha llevado al desarrollo de microambientes de ingeniería que imitan la complejidad de los tejidos vivos de 3 dimensiones, incluyendo la Matriz y modelos basados ​​en los andamios compuestos de materiales naturales tales como colágeno, o polímeros sintéticos sembraron con tipos específicos de células para crear microambientes similar a un tejido ^36-41. Enfoques de ingeniería también han incluido el uso de las plataformas de biorreactores para controlar y estudiar el entorno hormonal del microambiente ^18,19,41-43. Aunque los modelos biomiméticos y biorreactores proporcionan muchos elementos de un microambiente del tejido complejo en un entorno controlado, y se han aplicado con éxito para avanzar en el estudio de la metástasis del cáncer de mama al hueso ^{18,19,35,42,43,} sistemas de modelos de ingeniería por lo general no incorporan el espectro completo de tipos de células y componentes de la matriz extracelulares presentes en el entorno hueso nativo.

Hasta hace poco, el cáncer de mamacélulas no se han estudiado en el microambiente nativo, intacto, 3-dimensional de tejidos óseos humanos. Recientemente hemos informado de la elaboración de un modelo de co-cultivo utilizando fragmentos de tejidos óseos humanos aislados de reemplazo total de cadera (THR) cirugía especímenes ^44. Estos especímenes albergan tanto los compartimentos mineralizadas y ósea necesarias para estudiar los mecanismos subyacentes de micro-metástasis en cultivo a corto plazo. En trabajos anteriores hemos establecido una prueba de principio para el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para monitorear la proliferación de células de cáncer de mama que expresan luciferasa (MDA-MB-231-fLuc) co-cultivadas con fragmentos de hueso ^44. Aquí presentamos detallamos los protocolos experimentales para el estudio de la proliferación celular del cáncer de pecho, la colonización y la migración dentro del contexto de la microambiente nativo usando explantes de tejido óseo humano.

En primer lugar se presenta un protocolo para el co-cultivo de células de cáncer de seno adyacentes a fragmentos de hueso para medir mamala proliferación celular usando BLI. En esta sección, las suspensiones celulares de mama se siembran en forma de manchas de células en placas de 6 pocillos adyacentes a fragmentos óseos, que están inmovilizados por piezas de cera de hueso. Los pocillos de control contienen cera de hueso, pero no fragmento de hueso. Una vez manchas de células se adhieren, se añade medio y la placa se cultivaron durante 24 h, después de lo cual la intensidad de señal bioluminiscente (asociado con el número de células) se mide con BLI. En el siguiente paso se presentan métodos para células de cáncer de mama co-cultivo sembradas directamente sobre fragmentos de hueso para estudiar la colonización y proliferación. Aquí las suspensiones de células de mama se pipetean directamente sobre los fragmentos de tejido óseo, que se controlan mediante cultivo por BLI y microscopía de fluorescencia con el tiempo para realizar un seguimiento de la colonización y el número de células. En este método, el compartimiento de la médula se puede lavar a partir de los fragmentos de hueso en cualquier punto de tiempo para el análisis de las células de cáncer de mama colonizados por citometría de flujo, o los ensayos de viabilidad ósea.

Además, Deescriba dos enfoques diferentes para medir la migración de células de cáncer de mama. En el primer método pasos se describen para la medición de la migración hacia los sobrenadantes de cultivo de tejido óseo. En este protocolo las células de cáncer de mama se siembran en las superficies interiores, superiores de las membranas Transwell insertan con un 8 micras de tamaño de poro (como se muestra en la Figura 1A). Los insertos se colocan en un plato receptor con pocillos que contienen sobrenadante tejido óseo o medio de control. En el transcurso de un período de incubación de 20 h, pequeñas cantidades de células de cáncer de mama migran a través de las membranas de inserción hacia abajo en los pocillos de cultivo de tejidos más bajos donde se unen para la detección por BLI. En el segundo método de migración de las células de cáncer de mama se siembran en las superficies inferiores, exteriores de las membranas de inserción Transwell. Fragmentos de tejido de hueso se colocan en las tazas de inserción y las células de cáncer de mama migran a través de las membranas para colonizar los fragmentos de hueso (como se muestra en la Figura 1B), el cualluego son proyectados utilizando BLI.

Protocol

Cabezas femorales se obtuvieron de los pacientes sometidos a cirugía electiva THR en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Todos los tejidos se recogieron como muestras sin identificación, de acuerdo con las regulaciones de la Oficina de Cumplimiento de Investigación de la Universidad de Stanford. 1. Selección de una línea (s) Celular del Cáncer de Mama Obtener o transfectar la línea celular de cáncer de mama deseado (s) con un reporte…

Representative Results

El aislamiento de fragmentos de tejido de Cabezas femorales Cabezas femorales se obtuvieron de igual número de hombres y mujeres (44 a 90 años de edad) sometidos a cirugía electiva de reemplazo total de cadera en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Cada cabeza femoral desechado contiene una pequeña porción de la parte superior del fémur, que alberga el tejido óseo trabecular compuesto por espículas mineralizadas y ósea. Es…

Discussion

Mehra et al., Han descrito previamente la recogida y análisis de muestras de hueso postmortem de pacientes con cáncer de próstata metastásico cosechadas en el momento de la autopsia, que revela los tejidos de alta calidad y validar el uso de muestras de huesos humanos para estudiar el proceso metastásico ^47. Aquí hemos descrito los protocolos de recolección, procesamiento y uso de fragmentos de tejidos óseos humanos obtenidos de cabezas femorales desechados después de la cirugía THR en un s…

Materials

DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)