Metoder för Odling Human Lårben vävnadsexplantat att studera Breast Cancer Cell Colonization av Metastatisk Niche

Summary

Protokoll beskrivs för att studera bröstcancer cellmigration, spridning och kolonisering i en mänsklig benvävnad Explantation modellsystem.

Abstract

Ben är den vanligaste platsen för bröstcancer metastasering. Även om det är allmänt accepterat att mikromiljön påverkar cancercellen beteende, lite är känt om fastigheter bröstcancerceller och beteenden inom infödda mikro av mänsklig benvävnad. Vi har utvecklat metoder för att spåra, kvantifiera och modulerar humana bröstcancerceller inom mikro av odlade humana skelettvävnadsfragment isolerade från kasse femurhuvuden efter total höftledsplastik operationer. Använda bröstcancerceller konstruerade för luciferas och förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) uttryck, har vi möjlighet att reproducerbart kvantifiera migration och spridningsmönster som använder bioluminiscens imaging (BLI), spår cell interaktioner inom benfragment som använder fluorescensmikroskopi, och utvärdera bröstceller efter kolonisering med flödescytometri. De viktigaste fördelarna med denna modell är: 1) en infödd, arkitektoniskt intakt vävnad microeILJÖ som inbegriper relevanta humana celltyper, och 2) direkt tillgång till mikromiljö, vilket underlättar snabb kvantitativ och kvalitativ övervakning och störning av bröst- och ben cellegenskaper, beteenden och interaktioner. En primär begränsning, för närvarande, är det ändliga livskraft av vävnadsfragment, som begränsar fönstret i studien till korttidskultur. Tillämpningar av modellsystemet inkluderar studerar grundläggande biologi av bröstcancer och andra skelettsökande maligniteter inom metastaser nisch, och utveckla terapeutiska strategier för att effektivt nå bröstcancerceller i benvävnad.

Introduction

Tumören mikromiljö är allmänt erkänd som en kritisk faktor för cancercell beteende under bröstcancer progression och metastasering ^1-3. Målet med den metod som presenteras här är att underlätta studier av bröstcancerceller inom mikromiljön av mänsklig benvävnad, den vanligast förekommande stället för bröstcancermetastaser ^4-6. Bone består av mineraliserade och märg fack ^7-9, som båda hyser celler och utsöndrade faktorer inblandade i metastasutvecklingen ^10,11. Även flitigt i vivo musmodeller underlättar system studier av metastaserad processen ^12-15, cell interaktioner inom skelettet inte är lättillgängliga för observation och direkt störning. Modellsystem för att studera och odling musen benvävnad och mus benmärgsceller ger bättre åtkomst och har gett många insikter om överhörning och mekanismerna bakom bröstcancer cell metastasis av den murina skelettet ^16-22. Men studier har antytt att det kan finnas artspecifika mönster osteotropism för benvävnaden ^23,24. Dessa mönster kan återspegla inneboende artspecifika skillnader i benvävnad egenskaper, skillnader som härrör från förändrade benmärgs populationer i immunbristmöss ^11, och / eller den relativt unga ålder av möss som används i experiment, som alla är sannbestämnings benet mikromiljö.

In vitro metoder för att studera bröstcancerceller i humana skelett samkulturer har oftast fokuserar på specifika ben celltyper såsom märghärstammande osteoblaster eller stromala celler odlade som monoskikt, eller inom manipulerade 3-dimensionella modellsystem ^25-35. Även 2-dimensionell cellodlingsmodeller har bildat grunden för in vitro-metoder för cancerforskning, har det länge varit känt att cellens beteende är i grunden förändrad hos monolayer kultursystem ^18,36,37. Detta har lett till utvecklingen av konstruerade mikromiljöer som efterliknar de komplicerade 3-dimensionella levande vävnader, inklusive matris och ställningsbaserade modeller sammansatta av naturliga material såsom kollagen, eller syntetiska polymerer ympats med specifika celltyper att skapa vävnadsliknande mikromiljöer ^36-41. Engineered tillvägagångssätt har också användningen av bioreaktor plattformar för att styra och studera den hormonella miljön i mikromiljön ^18,19,41-43. Även biomimetiska modeller och bioreaktorer ger många delar av en komplex vävnad mikromiljö i en kontrollerad miljö, och har tillämpats med framgång för att främja studiet av bröstcancer metastaser till ben ^{18,19,35,42,43} behöver manipulerade modellsystem i allmänhet inte innehålla hela spektrat av celltyper och extracellulära matrixkomponenter som finns inom eget ben miljön.

Tills nyligen, bröstcancerceller har inte studerats inom den nativa, intakta, 3-dimensionella mikromiljö av humana benvävnader. Vi rapporterade nyligen att utveckla en co-kultur modell med benvävnadsfragment isolerade från total höftledsplastik (THR) kirurgi prover ⁴⁴ humana. Dessa prover hyser både de mineraliserade och märg fack som krävs för att studera mekanismerna bakom mikro metastas i korttidskultur. I tidigare arbete etablerade vi proof-of-princip för att använda bioluminiscens imaging (BLI) att övervaka spridningen av luciferas-uttryckbröstcancerceller (MDA-MB-231-Fluc) samar odlade med benfragment ^44. Här presenterar vi detaljerade experimentella protokoll för att studera bröstcancer cell cancer proliferation, kolonisering, och migration inom ramen för den infödda mikro använder mänskliga ben vävnadsexplantat.

Först presenterar vi ett protokoll för samarbete odling bröstcancerceller intill benfragment att mäta bröstcellproliferation med användning av BLI. I detta avsnitt, är bröst cellsuspensioner seedade som cell fläckar i 6-hålsplattor intill benfragment, som är immobiliserade med benbitar vax. Kontrollbrunnar innehåller benvax, men ingen benfragment. När cell fläckar fäster, är medelsätts och plattan är odlade för 24 timmar, varefter självlysande signalstyrkan (i samband med cellnummer) mäts med BLI. I nästa steg presenterar vi metoder för co-odling bröstcancerceller seedade direkt på benfragment att studera kolonisering och spridning. Här bröstet cellsuspensioner pipetteras direkt på benvävnaden fragment, som övervakas i kultur av BLI och fluorescensmikroskopi över tid för att spåra koloniseringen och mobilnummer. I denna metod, kan den märgutrymmet spolas ur benfragmenten vid någon tidpunkt för analys av koloniserade bröstcancerceller genom flödescytometri eller märg viabilitetsanalyser.

Dessutom har vi frånskriftlärd två olika metoder för att mäta bröstcancer cell migration. I den första metoden steg beskrivs för att mäta migrering mot benvävnad odlingssupernatanter. I detta protokoll de bröstcancerceller sås på de inre, övre ytor Transwell sätter membran med en 8 um porstorlek (som visas i figur 1A). Skären placerades sedan i en mottagningsplatta med brunnar innehållande benvävnad supernatant eller kontrollmedium. Under loppet av en 20 h inkubationsperiod litet antal bröstcancerceller migrerar genom insatsmembran ned i de undre vävnadsodlingsbrunnar där de fäster för detektering av BLI. I den andra migreringsmetod de bröstcancerceller sås på de nedre, yttre ytor Transwell insatsmembran. Bone vävnadsfragment placeras i insats kopparna och bröstcancerceller migrerar uppåt genom membranen att kolonisera benfragmenten (såsom visas i Figur 1B), vilketsedan avbildas med BLI.

Protocol

Femurhuvuden samlades in från patienter som genomgick elektiv THR kirurgi vid institutionen för Ortopedisk kirurgi vid Stanford University School of Medicine. Alla vävnader saml som avidentifierade prover i enlighet med reglerna i Research regelefterlevnad på Stanford University. 1. Val av en bröstcancercellinje (er) Skaffa eller transfektera önskad bröstcancer cellinje (s) med en luciferas-GFP reporter konstruktion. Följande experiment utfördes med användning av MDA-MB-231 och MCF-7 bröstc…

Representative Results

Isolera vävnadsfragment från femurhuvuden Femurhuvuden samlades från lika många manliga och kvinnliga patienter (44-90 år) som genomgår elektiv höftledskirurgi vid institutionen för Ortopedisk kirurgi vid Stanford University School of Medicine. Varje kasselårbenshuvudet innehåller en liten del av den övre femur, vilken härbärgerar trabekulär benvävnad består av mineraliserade nålar och märg. Denna vävnad är tillgänglig genom den kirurgiskt exponerade tvärsektion av axel…

Discussion

Mehra et al. Har tidigare beskrivit döden insamling och analys av skelettprover från metastaserande prostatacancer patienter skördas vid obduktionen, avslöjar högkvalitativa vävnader och validera användningen av mänskliga ben prover för att studera metastaser processen ^47. Här har vi beskrivit protokoll för insamling, bearbetning och användning av benvävnadsfragment mänskliga erhållits från kasse femurhuvuden efter THR kirurgi i en kortsiktig samodlingssystemet att studera bröstcellm…

Materials

DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)