Mammosphere تشكيل الفحص من الثدي البشري سرطان الأنسجة وخطوط الخلايا
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
وعلى غرار الأنسجة السليمة، وكثير من الدم والأورام الخبيثة الصلبة ويعتقد الآن أن يتم تنظيم هرمي، مع مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية الشبيهة الجذعية التي تجدد الذاتي بينما مما أدى إلى سلالة أكثر متباينة. فهم واستهداف هذه الخلايا الجذعية السرطانية في سرطان الثدي، والتي قد تكون في حوزتها تعزيز chemo- والمقاومة الراديو مقارنة مع غير الجذعية للورم بكميات كبيرة، وأصبحت مساحة البحثية الهامة. علامات بما في ذلك CD44، CD24، والنشاط ALDH يمكن تقييم باستخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) لعزل خلايا مستقبلي يتم عرضها تعزيز tumorigenicity عندما زرعها في الفئران المناعة: أصبح الفحص mammosphere أيضا تستخدم على نطاق واسع لقدرته على تحديد بأثر رجعي sphere- تشكيل الخلايا التي وضع من جذع واحد تشبه الخلايا المستنسخة. نحن هنا تحديد النهج لزراعة المناسبة من mammospheres من خطوط الخلايا أو عينات المرضى الأولية، والركض بها وحسابات لتقدير المجال وكفاءة orming (SFE). أولا نحن مناقشة الاعتبارات والعثرات الرئيسية في تخطيط وتفسير التجارب mammosphere المناسب.
Introduction
وجود الأنساب الخلية السرطانية برئاسة الخلايا الجذعية السرطانية الشبيهة الجذعية قد أضاف إلى حد كبير في فهمنا للورم عدم التجانس. في حين أن بعض التنوع المظهري في الأورام لا تنشأ من ثمرة نسيلي من الحيوانات المستنسخة متميزة وراثيا، يظهر عنصر جوهري أن تنجم عن الاختلافات جينية: يمكن أن الخلايا السرطانية الانتقالية (في بعض الأحيان عكسية) بين الجذعية، والسلف، والدول المتباينة عبر تفعيل أو قمع جين معين برامج التعبير 1 – 3. قد تعكس هذه الخلية العوامل الجوهرية أو خارجي، مما يعكس برنامج التعبير الجيني يجري أعرب حاليا في زنزانة مع إشارات لها autocrine الناتجة بالتزامن مع إشارات نظير الصماوي من مرض السرطان، اللحمية أو الخلايا المناعية المجاورة تقديم عوامل تغييري، والظروف microenviromental مثل درجة نقص الأكسجة 2،4،5.
على الرغم من أن النسب تتبع النهج المبتكرة تتقدم قدرتنا على دراسة الخلايا الجذعية السرطانية في الجسم الحي المفترضة في من مكانة 6-8، تبقى المقايسات تشكيل المجال نهج شعبية ومريحة لتقدير إمكانات خلايا سرطان الثدي "تتصرف مثل الخلايا الجذعية، على الأقل وفقا للشروط الفحص المستخدمة. وكثيرا ما يستخدم جنبا إلى جنب مع أساليب بأثر رجعي للخلايا الجذعية السرطانية تنقية، من خلال التعبير عنها من علامات غشاء CD44 CD24 و9، ومستويات نشاط الإنزيم ALDH (ألدهيد نازعة) 10، علامات التي تم اقتراحها لتتوافق مع أكثر mesenchymal- والظهارية الخلايا الجذعية السرطانية موازية على التوالي 11. وقد تم تطوير هذا النهج تشكيل المجال لأول مرة كما مقايسة neurosphere، مما يتيح نمو الخلايا الجذعية المفترضة من الحيوانات المستنسخة واحدة في غير ملتصقة، ظروف خالية المصل مع إضافة عامل النمو الظهاري (EGF) 12، في وقت لاحق يجري تطبيقها بشكل مفيد إلى وضعها الطبيعي وسرطانية أنسجة الثدي.
<p claق ق = "jove_content"> هوية الخلية مؤسس تشكيل المجال، وأنواع الخلايا المختلطة المكونة لكتلة المجال، هي ذات الصلة لالاستدلالات التي يمكن أن تكون مصنوعة من mammo-، أو غيرها من مجال تشكيل المقايسات. الخلايا على المدى الطويل العظام هادئة الحسنة الجذعية، يعتقد للراحة في مرحلة G0، سوف لا تواجه مزيج دقيق من العوامل التي من شأنها أن صالح التنشيط في الجسم الحي. الفحص mammosphere بدلا تمكن من نمو الخلايا إما معلقا لتقسيم الإنقسامية أو تقسيم بالفعل 13. هذه الأسلاف، وإن لم يكن خلية هادئة حقا، قد يكون مرحلة الخلية التي يتكاثر مع mitogens EGF وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) المستخدمة في الفحص. ومع ذلك، أنها تحتوي على مجموعة من الجذعية تنشيط الخلايا المرتبطة مسارات الإشارات 14. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معدل تكونها يتصل tumorigenicity من الأنسجة التي أخذت من، عندما تقاس قوتها في المقايسات تخفيف محدود في xenografts الماوس 2،15،16 </ سوب>.هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعزل الخلايا واحد وتوليد mammospheres الأساسي من كل من خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية والعينات السريرية للأورام الثدي. وصفنا أيضا كيفية تنفيذ الممرات المسلسل mammospheres الأولية لتقييم التجديد الذاتي، وكيفية حساب المجال تشكيل الكفاءة التي تسمح المقارنة بين الكثافة البذر مختلفة (انظر المخطط في الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد تقييم نجاح mammospheres الابتدائي والثانوي على الخلايا التي مطلي بكثافات منخفضة بما فيه الكفاية أن mammospheres شكل من الحيوانات المستنسخة واحدة، مع الحد الأدنى من المجال التجميع. لكن بكثافات التي هي منخفضة جدا، قليل جدا mammospheres قد شكل لتمييز تأثيرات المعالجات الإحصائية. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل BRC الامبراطوري، والمعهد الوطني للبحوث الصحية، والعمل لمكافحة السرطان مع إشارة خاصة إلى هيلاري كرافت والسير دوغلاس مايرز.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Referências
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
