İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
Sağlıklı dokuların, birçok kan ve katı maligniteler benzer şimdi daha farklılaşmış döl yol verirken kendine yenilemek kök benzeri kanser hücrelerinin bir alt kümesi olan, hiyerarşik olarak organize edilmesi düşünülmektedir. Anlama ve gelişmiş kemo ve olmayan kök tümör kitlesi ile karşılaştırıldığında radyo-dirence sahip olabilir meme kanserinde bu kanser kök hücrelerini hedefleyen, önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Mammosphere deneyi de yaygın olarak geriye dönük sphere- tespit kabiliyeti için kullanılır hale gelmiştir: CD44, CD24, ve ALDH aktivitesi de dahil olmak üzere Marker prospektif, bağışıklık farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşum nedenlerinin göstermek hücreleri izole etmek için (FACS), flüoresans ile aktifleştirilen hücre kullanılarak değerlendirilebilir Tek kök hücre benzeri klonlarının gelişir hücreleri oluşturur. Burada hücre kuşakları ya da primer hasta numuneleri, bunların pasajlayarak ve küre f tahmin etmek için hesaplamalar mammospheres uygun kültür için yaklaşımlar anlatılmaktadıroluşturmayan verimlilik (SFE). Önce uygun planlama ve mammosphere deneylerin yorumunda önemli hususları ve tuzaklar tartışmak.
Introduction
kök benzeri kanser kök hücreleri tarafından başkanlığında tümör hücre soylarının varlığı büyük ölçüde tümör heterojenite anlayışımıza ekledi. Tümörlerde bazı fenotipik çeşitlilik genetik olarak farklı klonların klonal akıbet kaynaklanan yok iken, önemli bir bileşeni epigenetik farklılıklar sonucu görünür: kanser hücrelerinin spesifik genin aktivasyonu veya baskı yoluyla kök, atası ve farklılaşmış devletler arasında (geri dönüşümlü olarak bazen) geçiş yapabilirsiniz ifade programları 1-3. Bu, şu anda modüle faktörleri veren kanser, stromal ve bağışıklık hücrelerinin komşu parakrin sinyal ile bağlantılı olarak elde edilen otokrin sinyalli bir hücrede ifade edilen gen ekspresyon programı yansıtan hücre iç ve dış faktörler yansıtır ve bu tür derecesi gibi microenviromental koşullar hipoksi 2,4,5.
Yenilikçi soy izleme yaklaşımlar olsa dain vivo niş 6 varsayılan kanser kök hücrelerini incelemek için yeteneğimizi ilerleyen – 8, küre oluşturan deneyler, en az kullanılan deney koşulları altında, kök hücreleri gibi davranmaya meme kanseri hücrelerinin potansiyelini tahmin etmek popüler ve kullanışlı bir yaklaşım kalır. Genellikle daha mesenchymal- ve epitel karşılık önerilmiştir membran belirteçleri CD44 ve CD24 9 ve enzim ALDH (aldehit dehidrojenaz) aktivitesi seviyeleri, 10, belirteçlerin bunların ifadesi ile, temizleme kanser kök hücreleri için geriye dönük yöntem ile birlikte kullanılır benzeri kanser kök hücreleri sırasıyla 11. Küre oluşumu yaklaşım, ilk olarak epitel büyüme faktörü (EGF), 12 ilavesi ile yapışkan olmayan, serumsuz koşullarda tek klonlardan putatif kök hücrelerinin büyümesini sağlayan neurosphere deneyi geliştirildi, daha sonra yararlı normal ve kanserli uygulanan meme dokularında.
<p clap = "jove_content"> küre oluşturucu kurucu hücre kimliği ve küre kitle oluşturan karışık hücre tipleri, meme ya da deneylerde oluşturan diğer küre yapılabilir çıkarımlar için de geçerlidir. Düşünce Uzun vadeli sakin kemik niyetli kök hücreleri, in vivo aktivasyon lehine olacağını faktörlerin kesin kombinasyonu karşılaşmazsınız, G0 fazında dinlenmek için. mammosphere tahlil yerine mitoz bölünme için dengelisin ya da zaten 13 bölünmesi ya hücrelerin büyümesini sağlar. Bu progenitörler, bir gerçek hareketsiz hücre de, testte kullanılan EGF ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), mitojen ile çoğalır hücre aşaması olabilir. Yine de, aktif kök hücre ilişkili sinyal bir dizi 14 yolaklarıyla içerirler. Buna ek olarak, bunların oluşum oranının fare ksenograftları 2,15,16 sınırlı seyreltme deneylerinde gücü ile ölçülen bölgeden alınan doku, tümöre neden olması ile de ilgilidir </ Sup>.Burada tek hücrelerin izole edilmesi ve insan göğüs kanseri hücre çizgileri ve göğüs tümörlerinin klinik örneklerde her iki primer mammospheres oluşturmak için ayrıntılı protokolleri sağlar. Biz de kendini yenileme değerlendirmek için birincil mammospheres seri pasajlar gerçekleştirmek için nasıl ve küre farklı ekim yoğunlukları arasında karşılaştırma (Şekil 1 şemaya bakınız) izin veren verimliliği oluşturan hesaplamak için nasıl açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birincil ve ikincil mammospheres Başarılı değerlendirme hücreleri az küre agregasyonu ile, tek klonlar formu mammospheres yeterince düşük yoğunluklarda kaplama olan dayanır. Bununla birlikte çok düşük yoğunluklarda, çok az mammospheres istatistiksel tedavisinin etkilerini ayırt oluşturabilir. Ekim yoğunluğu onların küre oluşturan verimlilikleri de önemli ölçüde değişebilir çünkü kullanılan her hücre hattı için optimize edilmelidir (Low-E-kaderin ifade olanlar daha az istikrarlı ve d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Hilary Craft ve Sir Douglas Myers ile anılmayı İmparatorluk BRC, Sağlık Araştırmaları Ulusal Enstitüsü ve Eylem Karşı Kanser tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Referências
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
