Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
Net als bij gezonde weefsels, veel bloed en solide tumoren zijn nu gedacht aan hiërarchisch georganiseerd worden, met een subset van stamcellen-achtige kankercellen die zichzelf te vernieuwen, terwijl die aanleiding geven tot meer gedifferentieerde nageslacht. Het begrijpen en zich richten op deze kankerstamcellen bij borstkanker, die verbeterde chemo- en radio-weerstand ten opzichte van de niet-stam tumor bulk kunnen bezitten, is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied. Markers zoals CD44, CD24 en ALDH activiteit kan beoordeeld worden met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om prospectief isoleren cellen die verbeterde tumorigeniciteit weergegeven wanneer geïmplanteerd in immunodeficiënte muizen: de mammosphere test ook worden veel gebruikt voor zijn vermogen om achteraf identificeren sphere- vormende cellen die zich ontwikkelen uit enkele stamcel-achtige klonen. Hier schetsen we benaderingen voor de juiste kweken van mammospheres uit cellijnen of primaire monsters van patiënten, hun passage, en berekeningen te schatten bol forming efficiëntie (SFE). Eerst bespreken we de belangrijkste overwegingen en valkuilen in de juiste planning en interpretatie van mammosphere experimenten.
Introduction
Het bestaan van de tumor cellijnen onder leiding van de stam-achtige kanker stamcellen is sterk toegevoegd aan ons begrip van de tumor heterogeniteit. Terwijl sommige fenotypische diversiteit in tumoren komt voort uit de klonale uitgroei van genetisch verschillende klonen, verschijnt er een substantieel onderdeel te vloeien uit epigenetische verschillen: kankercellen kan (soms reversibel) overgang tussen stam, stamvader, en gedifferentieerde staten via activering of onderdrukking van specifiek gen expressie programma's 1-3. Dit kan cel intrinsieke of extrinsieke factoren weerspiegelen, die de genexpressie programma dat momenteel wordt uitgedrukt in een cel met de resulterende autocriene signalering in samenhang met paracrienen van naburige kanker, stromale of immuuncellen leveren modulerende factoren en microenviromental omstandigheden zoals de mate van hypoxie 2,4,5.
Hoewel innovatieve lineage tracing benaderingenrukken ons vermogen om vermeende kanker stamcellen bestuderen in hun in vivo niche 6-8, bol vorming assays steeds een populaire en handige op mogelijke borstkankercellen 'schatten gedragen als stamcellen, althans onder de assay omstandigheden. Het wordt vaak gebruikt naast achteraf werkwijzen voor het zuiveren van kanker stamcellen, hun expressie van membraan merkers CD44 en CD24 9 en activiteit van het enzym ALDH (aldehyde dehydrogenase) 10 markers die zijn voorgesteld overeenkwam met meer mesenchymal- en epitheliale -achtige kanker stamcellen respectievelijk 11. De bol vorming benadering werd eerst ontwikkeld als neurosphere assay, waardoor de groei van putatieve stamcellen uit één klonen in niet-hechtende, serumvrije omstandigheden met de toevoeging van epitheliale groeifactor (EGF) 12, later wordt nuttig toegepast om de normale en kankerachtige borstweefsel.
<p class = "jove_content"> De identiteit van de bol vormende grondlegger cel en de gemengde celtypen waaruit de bol massa, zijn relevant voor de gevolgtrekkingen kunnen worden gemaakt van mammo- of andere bol vormende assays. Langlopende latente bot fide stamcellen, dacht te rusten in G0 fase, zal niet de ervaring van de precieze combinatie van factoren die activering in vivo zou bevoordelen. De mammosphere test plaats maakt de groei van cellen ofwel klaar voor mitotische deling of reeds verdelen 13. Deze progenitors, hoewel niet echt rustende cel, kan de cel stadium dat proliferates met EGF en basische fibroblast groeifactor (bFGF) mitogenen in de assay. Niettemin, ze bevatten een reeks van geactiveerde stamcellen geassocieerde signaaltransductiewegne 14. Bovendien is de snelheid van hun vorming betreft de tumorigeniciteit van het weefsel van opname van, gemeten door hun vermogen in beperkte verdunning assays muis xenotransplantaten 2,15,16 </ Sup>.Hier geven we gedetailleerde protocollen enkele cellen isoleren en te kweken primaire mammospheres zowel humane borstkankercellijnen en klinische monsters van borsttumoren. We beschrijven ook hoe seriële passages van primaire mammospheres voeren om zelf-vernieuwing te beoordelen, en hoe te berekenen bol vormen efficiëntie die vergelijking over verschillende zaaien dichtheden (zie schema in figuur 1) mogelijk maakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Succesvolle evaluatie van de primaire en secundaire mammospheres vertrouwt op cellen worden uitgeplaat bij voldoende lage dichtheden die vorm mammospheres van enkele klonen, met minimale bol aggregatie. Maar op dichtheid te laag zijn, te weinig mammospheres kunnen vormen om de effecten van behandelingen statistisch onderscheiden. Zaaien dichtheid moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt omdat ze aanzienlijk in hun bol vormen efficiëntie kan variëren (die uitdrukken lage E-cadherine kan minder stabiel en …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de Keizerlijke BRC, het National Institute for Health Research, en kankerbestrijding met speciale vermelding voor Hilary Craft en Sir Douglas Myers.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Referências
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
