Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
בדומה לרקמות בריאות, רב דם ומחל ממאירות סולידיות עכשיו חשבו להיות מאורגן באופן היררכי, עם תת-קבוצה של תאי סרטן כמו גזע שעצמי לחדש-בזמן והוליד צאצאים מובחנים יותר. הבנה ומיקוד תאים אלה גזע סרטני בסרטן השד, אשר עשוי להחזיק chemo- משופר והרדיו-התנגדות בהשוואה לגידול בכמות גדולה אינו גזע, הפכה אזור חשוב מחקר. סמנים כוללים CD44, CD24, ופעילות ALDH ניתן להעריך באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד מכאן ולהבא תאים המציגים tumorigenicity משופר כאשר מושתלים לעכברי מדוכאי חיסון: גם assay mammosphere הפך בשימוש נרחב ביכולתה לזהות sphere- למפרע יצירת תאים המתפתחים משיבוטים כמו תא גזע בודד. כאן אנו מתארים גישות לculturing המתאים של mammospheres משורות תאים או דוגמאות מטופל עיקריות, passaging, וחישובים להעריך f תחוםיעילות orming (SFE). ראשית עלינו לדון בשיקולים מרכזיים ואת חסרונות בתכנון ובפרשנות של ניסויי mammosphere המתאימים.
Introduction
קיומם של שושלות תאים הסרטניים בראשותו של תאי גזע סרטני כמו גזע הוסיף רב להבנת ההטרוגניות גידול שלנו. בעוד קצת גיוון פנוטיפי בגידולים אין נובע מהתולדה המשובט של שיבוטים גנטיים שונים, רכיב מהותי מופיע לנבוע מהבדלים אפיגנטיים: תאים סרטניים יכולים לעבור (לפעמים הפיך) בין גזע, אב, ומדינות מובחנות באמצעות הפעלה או דיכוי של גן ספציפי תוכניות ביטוי 1-3. זה עשוי לשקף גורמים פנימיים או חיצוניים תא, המשקף את תכנית ביטוי גנים בימים אלה באים לידי ביטוי בתא עם איתות autocrine התוצאה שלה בשילוב עם המנגנון פאראקריני משכנות סרטן, סטרומה או תאי מערכת חיסונית ומספק גורמי modulatory, ותנאי microenviromental כגון מידת היפוקסיה 2,4,5.
למרות גישות שושלת התחקות חדשניות מתקדמים את היכולת שלנו ללמוד תאי גזע סרטני משוערים בנישה שלהם in vivo 6-8, מבחני יוצרי תחום להישאר גישה פופולרית ונוחה להעריך את הפוטנציאל של תאי סרטן השד להתנהג כמו תאי גזע, לפחות בתנאי assay בשימוש. הוא משמש לעתים קרובות לצד שיטות רטרוספקטיבית לתאי גזע סרטני טיהור, על ידי הביטוי שלהם CD44 סמני קרום ו -9 CD24, ורמת הפעילות של ALDH (dehydrogenase אלדהיד) האנזים 10, סמנים שהוצעו למתאימים ליותר mesenchymal- ואפיתל תאי גזע סרטני דמויים בהתאמה 11. גישת היווצרות הכדור פותחה לראשונה כassay neurosphere, מה שמאפשר את הצמיחה של תאי גזע המשוערת משיבוטים בודדים בתנאים שאינם חסיד, סרום חופשיים עם התוספת של גורם גדילת אפיתל (EGF) 12, לאחר מכן מיושם מועיל למצב נורמלי וסרטני רקמות שד.
<p class = "jove_content"> הזהות של תא מייסד יוצרי תחום, וסוגי התאים המעורבים המרכיבים את מסת הכדור, רלוונטיים למסקנות שיכולות להיות עשויה מmammo-, או-תחום אחר להרכיב מבחני. תאים לטווח ארוך עצם שקט בתום גזע, חשבו לנוח בשלב G0, לא תוכל לחוות את השילוב המדויק של גורמים שהיה מעדיפים הפעלה in vivo. Assay mammosphere במקום מאפשר את הצמיחה של תאים או בכוננות חלוקת mitotic או שכבר חילקו 13. אבות אלו, אם כי לא תא באמת שקט, עשויים להיות שלב התא שמתרבה עם mitogens EGF וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) המשמשת בassay. אף על פי כן, הם מכילים מגוון של האיתות הקשורים בתאי גזע מופעל מסלולים מ-14. בנוסף, קצב היווצרותם מתייחס לtumorigenicity של הרקמות שנלקחו מ, כשהיא נמדדת בעצמה שלהם במבחני דילול מוגבלים בxenografts עכבר 2,15,16 </ Sup>.כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבודד תאים בודדים וליצור mammospheres עיקרי משני קווים אנושיים סרטן שד תא ודגימות קליניות של גידולים בשד. אנו גם מתארים כיצד לבצע קטעים סידוריים של mammospheres העיקרי להעריך התחדשות עצמית, וכיצד לחשב תחום יצירת יעילות המאפשרת השוואה בין צפיפות זריעה שונה (ראה תכנית באיור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
הערכה מוצלחת של mammospheres הראשוני והמשני מסתמכת על תאים שמצופים בצפיפויות נמוכות מספיק שmammospheres צורה משיבוטים אחד, עם צבירת תחום מינימאלית. עם זאת בצפיפויות נמוכות מדי, מעט מדי mammospheres עלול להיווצר להבחין את ההשפעות של טיפולים סטטיסטיים. צפיפות זריעה צריכה להיות מותאמת ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקיסרי BRC, המכון הלאומי לחקר בריאות, והפעולה נגד הסרטן עם אזכור מיוחד להילארי קרפט וסר דאגלס מאיירס.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Referências
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
